橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库的构建与EST测序分析

 【目的】构建橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库,降低胶乳中存在的高丰度表达基因的拷贝数,提高胶乳表达基因的分离鉴定和EST测序分析效率。【方法】以橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳为材料,将胶乳全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了橡胶树胶乳的非剪切型全长cDNA原始文库,经检测原始文库的滴度为6.0×106 cfu/mL,平均插入片段长度大于1.5 kb,重组率约为100%,全长cDNA比例约为76%;利用基因组DNA饱和杂交技术对胶乳原始cDNA文库进行均一化处理,构建橡胶树胶乳的均一化全长cDNA文库。【结果】胶乳均一化全长cDNA文库的总库容量(总CFU)为1.87×105,重组率大于95%。定量RT-PCR检测表明,橡胶树胶乳2个高丰度表达基因,即小橡胶粒子蛋白(SRPP)和橡胶延长因子(REF)基因,在均一化cDNA文库中的表达量均下降了约1 000倍。【结论】构建了均一化效果良好的橡胶树胶乳全长cDNA文库,并对文库中随机的12 000个克隆进行了测序,获得高质量的有效EST(expressed sequence tag)序列为11 951条,经拼接共获得单一基因(unigene)为3 394个,其中包括片段重叠群(contig)2 061个和单一EST序列(singlet)1 333个。此cDNA文库将可用于橡胶树功能基因组研究、新基因筛选、高通量EST测序以及橡胶树胶乳cDNA芯片的制备。     

冀228纤维均一化全长cDNA文库的构建与鉴定分析

【目的】构建优质陆地棉栽培品种冀228纤维均一化全长cDNA文库,降低纤维中存在的高峰度基因的拷贝数,提高发现纤维发育相关基因随机序列和稀有基因的效率,为公共数据库提供丰富的陆地棉EST资源。【方法】以优质陆地棉冀228开花后8-40 d纤维为材料,将纤维全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了棉花纤维的非剪切型全长cDNA原始文库。利用均一化技术获得均一化全长cDNA文库,进而测序获得大量的EST序列。采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接、比对、COG功能注释和GO注释。【结果】构建了优质陆地棉冀228纤维均一化全长cDNA文库,该文库初级文库库容为1.06×10⁷,初级文库的滴度为3.56×10⁶ cfu·mL^-1,平均片段长度为1.2 kb。qRT-PCR检测均一化程度结果表明,棉花2个高峰度表达基因在该文库中的表达量均下降了1 000倍。随机选取2 384个克隆进行单向测序,获得2 169条高质量的表达标签（EST）,拼接成1 745个单一基因（Unigene）;同源比对分析表明,70%的Unigenes与已知功能基因具有较高的同源性。基因进行COG功能分类结果显示,较多的COG功能分类集中在“翻译、核糖体结构和生物转化”、“碳水化合物运输与代谢”和“翻译后修饰、蛋白转移及蛋白伴侣”功能上。根据基因的GO注释结果,参与细胞构成、细胞器和膜构成的基因比例最高,参与细胞过程和新陈代谢等过程的基因比例较高,具有结合和催化功能的基因较多,这些基因可能在棉纤维发育中发挥比较重要的作用。【结论】构建了优质陆地棉栽培品种冀228纤维均一化全长cDNA文库,经文库质量检测、均一化程度检测和随机选取克隆的测序分析结果表明,文库的代表性和重组片段的完整性均达到了分离筛选目的基因的建库要求,整个文库有着很高的非冗余性。构建的cDNA文库具有既能获得与已知序列同源性很高的基因,又能挖掘出优质陆地棉冀228特有的基因或同源序列的作用,能够提高发现纤维发育相关基因随机序列和稀有基因的效率,将为公共数据库提供丰富的陆地棉EST资源。     

亚洲棉（Gossypium arboreum L.）全生育期均一化全长cDNA文库的构建和鉴定

 【目的】构建二倍体亚洲棉石系亚1号全生育期均一化全长cDNA文库,建立亚洲棉功能基因组学研究基础平台,发掘亚洲棉发育、抗逆等相关基因。【方法】取石系亚1号子叶期、苗期、蕾期、花铃期不同组织器官,提取总RNA并分离纯化mRNA,采用SMART技术反转录全长双链cDNA。用DSN（duplex-specific nuclease）法对全长双链cDNA进行均一化,均一化的cDNA连接到λZAPⅡ载体,包装蛋白包装后构建石系亚1号全生育期均一化全长cDNA文库。【结果】初级文库滴度4×106 pfu?ml-1,库容2×106个独立克隆,重组率大于95%,插入片段平均长度大于1.5 kb。随机挑取192个克隆进行EST（expressed sequence tags）测序,冗余度仅为3.49%。BLASTN比对结果显示：78.31%的EST为新EST。【结论】文库均一化效果良好,质量符合要求,可能包含大量新基因,是进行EST测序、发掘新基因等棉花功能基因组学的研究平台。     

烟草叶片全长cDNA文库构建及EST序列分析

【目的】构建烟草叶片全长cDNA文库并测序,发掘与烟叶发育、代谢和抗逆相关的基因,为进一步研究功能基因奠定基础。【方法】以烟草苗期叶片为试验材料,利用改进的Cap-trapper法构建烟草叶片全长cDNA文库。利用测序技术获得大量的EST序列,采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接和功能注释。【结果】构建了烟草叶片的全长cDNA文库,该文库滴度为1.2×106 pfu•mL-1,平均插入片段在1.4 kb左右。利用该文库测序了5 280个克隆,获得5 233条高质量表达序列标签（EST）,序列拼接出3 922个单一基因;同源比对分析表明,89.7%的基因与已知功能基因具有较高的同源性,这些基因涉及细胞生长、信号转导、翻译合成、抗逆反应和能量代谢等功能;并详细鉴定了部分与烟碱合成和抗病相关的基因。【结论】通过Cap-trapper法成功构建了高质量的烟草幼苗叶片全长cDNA文库;大规模EST测序分析挖掘到大量与烟草幼苗叶片发育、抗逆、抗病、烟碱代谢相关的侯选基因。     

棉花花药全生育期均一化全长cDNA文库的构建和分析

【目的】深入了解棉花花药发育的分子机制,并为其不育机理的研究提供参考序列。【方法】构建棉花花药全生育期的均一化全长cDNA文库并测序获得9 896条高质量的EST,利用生物信息学和荧光定量相结合法对所得数据进行系统分析。【结果】该cDNA文库库容为1.2×107,插入片段分布在1—3 kb。将所测得的高质量EST进行拼接得到6 643条unigenes,平均长度为779 bp。经过序列比对注释和生物信息学分析,得到一系列在棉花花药发育过程中起重要作用的基因,并获得28条参与花粉壁合成的基因。荧光定量结果表明,这些基因均在花药发育前期优势表达,尤其是在四分体时期表达量最高。【结论】获得大量的棉花花药表达基因,并分析得到一些调节棉花花药发育的重要途径以及参与棉花花粉壁合成相关基因。     

粗山羊草（Ae.tauschii）幼苗和根全长cDNA文库构建及其EST注释与比较分析

 【目的】构建小麦D基因组供体粗山羊草根和叶的全长cDNA文库，探讨利用生物信息学方法分析发掘组织特异性表达基因的可行性。【方法】本研究利用Cap-trapper方法构建全长cDNA文库，利用高通量测序技术获得大批高质量EST序列，在基于Linux系统的本地化生物信息学分析平台上对上述EST进行了电子注释分析。【结果】成功构建了粗山羊草根和叶的全长cDNA文库，测序获得根EST序列6 973条和叶EST 6 616条。利用本地化数据分析平台对其进行功能注释。利用GO-Diff软件，发现了两个文库间表达基因的功能差异，找到组织间表达差异显著的基因和组织内特异性表达的基因。【结论】利用构建的全长cDNA测序获得大量EST序列，通过生物信息学方法挖掘差异表达或特异性表达基因的方法是可行的。     

春大豆花芽cDNA文库的构建及质量分析

【目的】为了解大豆多荚、多粒相关基因的调控机制,构建了大豆花芽cDNA文库,根据要求初步鉴定了所构建文库的质量.【方法】以大豆吉农18突变体的幼嫩花芽为材料提取总RNA,采用SMART技术合成双链cDNA.经蛋白酶K的消化及SfiⅠ酶切后,将所得cDNA克隆到λTriplEx质粒载体中,成功构建了大豆花芽全长cDNA文库.【结果和结论】将初始文库经扩增后保存,检测扩增文库滴度为2.13×108pfu/mL,重组率接近95.3%,菌落PCR鉴定插入片段主要分布在0.5~2.0 kb.插入片段平均大小在1.0 kb左右.表明本研究所构建的文库既满足了目的基因的分离筛选,又可保证全长cDNA文库的获得,该文库的构建为进一步开展相关基因的克隆及分子生物学研究奠定基础.     

蜡梅花cDNA文库构建及其高频出现脂转移蛋白cDNA的表达

【目的】构建蜡梅花cDNA文库，分析蜡梅脂转移蛋白基因的表达，为探索蜡梅冬季开花分子机理，分离克隆特色基因奠定基础。【方法】以蜡梅花器官为材料，用SMART cDNA Library Construction Kit 构建文库，RT-PCR分析基因表达。【结果】经测定原始文库滴度达到1.4×106 pfu/ml，扩增总文库滴度约为1010pfu/ml，重组率达到96%，插入片段在0.5 kb 以上，平均约1.1 kb，通过PCR 检测，从总文库中检测到了表达丰度不同的蜡梅PI、AP3和LTP基因的特异片段，说明所构建的文库覆盖度高、代表性强，LTP基因具有内含子，而总文库中扩增出的LTP基因不含内含子，说明所构建的cDNA文库无基因组DNA污染， LTP基因在蜡梅开花各个时期均表现较高的转录水平，与EST分析时高频率出现LTP序列的情况相符，证实所构建的文库能够反映蜡梅开花过程基因表达的基本情况。【结论】已获得高质量的蜡梅花cDNA文库，可以用于进一步的基因克隆或EST测序分析，这是首次正式报道蜡梅cDNA文库的构建。LTP基因在蜡梅开花过程中可能具有重要的生物学功能，为探索蜡梅冬季开花分子机理提供了线索。     

凡纳滨对虾肌肉组织cDNA全长文库的构建

【目的】为了在短期内获得大量凡纳滨对虾肌肉组织的功能基因表达信息,为深入了解功能基因在凡纳滨对虾肌肉组织中的表达提供分子生物学依据。【方法】通过构建凡纳滨对虾肌肉组织的全长cDNA文库,并进行EST测序分析。【结果】文库质量分析表明,初始文库库容约8．50×10^6 CFU,重组率在95％左右,插入片断大小为0．5～4．0kb,多数在1．0kb以上。随机测序72条cDNA,可得到有功能注释的37条全长cDNA和18条编码未知蛋白的基因序列。通过Gene Ontology功能分类可将有功能注释的37个基因分为蛋白质合成、细胞骨架、细胞信号传导、代谢、转运、能量、转录、抗病及防御、生殖发育和未知功能基因等10类,其中蛋白质合成类基因最多（27．03％）,与细胞骨架（13．51％）、细胞信号传导（13．51％）及代谢类基因（13．51％）共占67．56％。【结论】构建凡纳滨对虾肌肉组织的全长cDNA文库,可实现短期内获得大量凡纳滨对虾肌肉组织的功能基因表达信息.     

鮸鱼EST-cSNP位点发掘及其特征分析

为发掘鮸鱼的EST-cSNP位点,以测序获得的鮸鱼脾脏4609条高质量表达序列标签(expressed sequence tags,EST)序列为源序列,利用Vector NTI 11.0软件拼接出707条重叠群(contig)序列,检测到209个可信度高的编码区单核苷酸多态性(coding-region single nucleotide polymorphism,cSNP)位点;SNP位点数在包含SNP序列中的发生概率为0.743%,在209个SNP位点中包含114个碱基转换位点、74个碱基颠换位点和21个插入缺失位点,转换与颠换比为1.54;对所鉴定的SNP位点的相关序列进行基因注释表明,这些序列包括一批与免疫抗逆相关的基因,例如主要组织相容性复合体、免疫球蛋白、T细胞受体以及各类蛋白酶等.说明所发掘的SNP将有助于促进鮸鱼的分子遗传学及分子辅助育种研究.     

Construction of a Full-Length cDNA Library of Gossypium hirsutum L.and Identification of Two MADS-Box Genes

A full-length normalized cDNA library for the flower development stages of short-season cotton(Gossypium hirsutum L.)(CCRI36)was constructed.A total of 3 421 clones were randomly selected for sequencing,with a total of 3 175 effective sequences obtained after removal of empty-carriers and low-quality sequences.Clustering the 3 175 high-quality expressed sequence tags(ESTs)resulted in a set of 2 906 non-redundant sequences comprised of 233 contigs and 2 673 singletons.Comparative analyses indicated that 913(43.6%)of the unigenes had homologues with function-known genes or functionassumed genes in the National Center for Biotechnology Information.In addition,763(36.4%)of the unigenes were functionally classified using Gene Ontology hierarchy.Through EST alignment and the screening method,the full-length cDNA of two MADS-box genes viz.,GhMADS11 and GhMADS12 were acquired.These genes may play a role in flower development,Phylogenetic analysis indicated that GhMADS11 and GhMADS12 had high homology and close evolutionary relationship with AGL2/SEP-type and PI-type genes,respectively.The expression of both GhMADS11 and GhMADS12,genes was high in reproductive organs.In floral organs,GhMADS11 expression was high in petals(whorl2)and ovules,while GhMADS12 expression was high in petals(whorl2)and stamens(whorl3).Results show that the EST strategy based on a normalized cDNA library is an effective method for gene identification.The study provides more insights for future molecular research on the regulation mechanism of cotton flower development.     

大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因(Gm VTE3)的克隆及对转基因烟草种子中生育酚组成的影响

【目的】克隆大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因(GmVTE3),研究其在烟草中过量表达对转基因烟草种子中生育酚(维生素E)组分的影响。【方法】利用EST拼接和RT-PCR技术,从大豆中分离了大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶(VTE3)的全长cDNA序列,通过烟草转化研究过量表达VTE3对转基因植株维生素E组分的影响。【结果】GmVTE3全长1026bp,编码342个氨基酸,与其它物种的VTE3氨基酸同源性很高,在烟草中过量表达该基因使烟草种子中γ-生育酚与δ-生育酚的比值最高增加2倍。【结论】首次克隆了大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因GmVTE3,它能够催化烟草植株中2-甲基-6-植基-1,4-苯醌(MPBQ)的甲基化,从而改变烟草种子中生育酚的组成成分。说明可以利用克隆的GmVTE3来改变植物种子中生育酚的组成和提高α-生育酚的含量。     

cDNA文库构建策略及其在盐生植物中的应用

构建各种cDNA文库是目前发现新基因的基本策略,同时也是功能基因组学研究的一个主要方法.cDNA文库主要包括cDNA全长文库、cDNA差减文库和cDNA均一化文库等类型,各种文库的原理、构建方法和适用范围都有很大的不同.近年来,通过构建各种cDNA文库、获得大规模高质量EST数据库,并在此基础上分离克隆抗逆相关基因已经成为研究植物耐盐机理的重要途径.旨在对cDNA文库的主要类型及其构建策略,以及cDNA文库在盐生植物新基因筛选中的应用进行综合论述,并对植物耐盐机制的研究提出了展望.