猪瘟病毒Erns和E2基因在昆虫细胞中的表达研究

利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)Erns和E2基因,用于CSFV新型疫苗以及建立相关的血清学诊断方法等研究.从猪瘟病毒石门株血液样品中提取总RNA,对Erns及E2基因进行扩增,将产物回收后分别连接于T载体,酶切及测序分析后,将其亚克隆至真核表达转移栽体pFastBacHT经重组筛选后获得杆状病毒重组质粒,重组质粒转染昆虫细胞sf9后连续传3～4代,分别收获细胞上清液及沉淀,用于SDS-PAGE及western-blotting试验,检测重组Erns,E2基因表达蛋白.用抗组氨酸(His)单克隆抗体在表达细胞中检测到Erns重组的His标签蛋白;应用抗E2蛋白单克隆抗体在表达细胞及培养上清液中检测到E2基因表达蛋白.结果表明在杆状病毒系统中成功表达了CSFV Erns和E2蛋白.     

猪瘟病毒E~(rns)和E2基因在昆虫细胞中的表达研究

利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)Erns和E2基因,用于CSFV新型疫苗以及建立相关的血清学诊断方法等研究.从猪瘟病毒石门株血液样品中提取总RNA,对Erns及E2基因进行扩增,将产物回收后分别连接于T载体,酶切及测序分析后,将其亚克隆至真核表达转移载体pFastBac HT经重组筛选后获得杆状病毒重组质粒,重组质粒转染昆虫细胞sf9后连续传3~4代,分别收获细胞上清液及沉淀,用于SDS-PAGE及Western-blotting试验,检测重组Erns,E2基因表达蛋白.用抗组氨酸(His)单克隆抗体在表达细胞中检测到Erns重组的His标签蛋白;应用抗E2蛋白单克隆抗体在表达细胞及培养上清液中检测到E2基因表达蛋白.结果表明在杆状病毒系统中成功表达了CSFV Erns和E2蛋白.     

猪瘟兔化弱毒株E~(rns)基因在大肠埃希氏菌中的表达、纯化

将猪瘟兔化弱毒株Erns基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,经PCR和双酶切鉴定以及序列分析,表明已成功构建了重组质粒。将重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)中进行表达,经SDS-PAGE和Western-Blot检测,结果表明,融合表达蛋白的分子量约为55kD,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的45%。表达蛋白与兔抗CSFV多抗发生特异性反应,具有良好的反应原性。利用GST亲和层析柱对Erns融合蛋白进行了纯化。     

牛气管抗菌肽在毕赤酵母中的表达及条件优化

根据已发表的牛气管抗菌肽(bTAP)序列和酵母密码子偏爱性设计并合成一段bTAP DNA序列,将其与毕赤酵母pPIC9K质粒连接后构建了分泌表达载体pPIC9K-bTAP.获得重组质粒经Sal Ⅰ酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选获得了阳性转化重组菌.通过对重组菌培养条件的进一步优化,揭示了重组...     

牦牛IFN-β基因在毕赤酵母中的分泌表达

用真核表达引物从pGEM-yakIFN-β重组质粒中扩增出牦牛IFN-β基因,将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E.coli的JM109中,得到pPIC9K-yakIFN-β重组表达质粒.通过电击法将经SalⅠ线性化的pPIC9K-yakIFN-β质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中,采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,利用甲醇诱导表达,分泌表达产物用MTT法检测其生物学活性.经SDS-PAGE电泳分析表明:表达出约22ku大小分泌于胞外的牦牛IFN-β蛋白分子量,比理论值稍大;MTT结果表明:纯化的重组yak-IFN-β蛋白具有促进淋巴细胞增殖的活性.     

东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST的表达、纯化及抑菌活性分析

  【目的】利用毕赤酵母菌真核表达系统重组表达东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST,分析评价dybowskin-1ST的抑菌活性。【方法】采用TRIzol法提取蛙皮总RNA,经RT-PCR扩增获得抗菌肽dybowskin-1ST基因,将目的基因克隆到毕赤酵母菌分泌型表达质粒pPIC9K中,得到重组质粒pPIC9K-1ST。经电转化将pPIC9K-1ST转入到毕赤酵母菌GS115中,获得高效表达dybowskin-1ST的重组菌株。以甲醇诱导重组菌株,上清液经SDS-PAGE检测表明有目的蛋白dybowskin-1ST分泌表达。目的蛋白经Ni-agarose色谱柱分离纯化后,对大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肠炎沙门氏菌和蜡状芽孢杆菌进行抑菌活性分析。【结果】成功构建了东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST的毕赤酵母真核表达系统,且dybowskin-1ST对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有良好的抑菌效果。【结论】东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST具有良好的广谱抗菌活性和潜在的研发价值。     

山羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建及表达

从重组克隆载体pMD18-P32中扩增出山羊痘病毒P32基因,与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9K-P32.重组质粒pPIC9K-P32用Sal I线性化后,与毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115混合后电转化,使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组.采用G418抗性梯度筛选法得到高拷贝重组菌株,甲醇诱导目的基因表达.SDS-PAGE和Western-blotting分析结果表明,用酵母成功表达出了31kD的重组蛋白,该蛋白具有生物学活性,能被山羊痘阳性血清识别.     

人组织激肽释放酶在Pichia pastoris酵母中的表达

通过将人组织激肽释放酶(hKLK1)原编码序列克隆入Pichia pastoris酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组表达质粒pPIC9K-KLK1.分别用Sal Ⅰ及Bgl Ⅱ酶切线性化后电转化酵母菌株GS115,经MD平板及含不同抗性浓度G418的YPD平板上培养筛选,获得抗3 mg/ml G418 Mut+型分泌表达hKLK1的重组酵母菌4株,抗1 mg/mlG418 Muts型分泌表达hKLK1的酵母菌3株.酶活性测定数据表明:高拷贝转化子重组蛋白表达量高于低拷贝转化子;Mut+型转化子重组蛋白表达量高于Muts型转化子;且当甲醇诱导体积分数为2%时,重组蛋白的表达量最高.进一步的Western-blotting分析证明,表达的重组hKLK1分子质量正确,能被特异的抗体识别.     

稻瘟病菌一假定几丁质酶在毕赤酵母中的表达

本研究从稻瘟病菌菌株Guy11中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增到一假定几丁质酶基因MGG_08054.6的cDNA序列,将其亚克隆至带有His-tag标签的酵母表达载体pPIC3.5K中,构成重组质粒pPIC3.5K-ws,电击转化至毕赤酵母菌菌株GS115,通过MD-MM平板筛选及PCR验证获得重组酵母转化子GS115-PICH-ws;阳性转化子在甲醇诱导下,成功分泌出重组蛋白.SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子质量为48 ku,与其理论计算值基本相符;Ni-NTA法分离纯化后的重组蛋白经DNS法测定具有几丁质酶活性.     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在毕赤酵母中的表达及鉴定

为了在毕赤酵母中高效表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及研制具有粘膜免疫佐剂活性的无毒重组LTB,采用PCR方法从产毒型大肠杆菌H44815菌株扩增获得LTB完整编码区DNA,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K的分泌信号肽基因下游,构建真核表达载体pPIC9K-LTB;重组质粒经核苷酸测序确认并线性化后电转化毕赤酵母菌株KM71,PCR筛选转化子,并以小量诱导表达筛选高效表达工程菌株,最后Western blotting分析甲醇诱导上清中的LTB及采用亲和层析和HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化蛋白。结果表明,PCR克隆获得的LTB编码DNA序列与GenBank登录DNA序列完全一致,定向插入pPIC9K载体,可获得表达LTB的酵母分泌表达载体pPIC9K-LTB;电转化后的重组酵母菌KM71诱导表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,发现甲醇诱导的培养基上清中含LTB,且具有较好的免疫原性。     

猪瘟病毒石门株E2基因4个抗原结构域的原核表达

【目的】对猪瘟病毒石门株E2基因进行原核表达，以期获得可溶性表达产物，为检测猪瘟抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。【方法】用PCR技术扩增了重组S21质粒载体上的猪瘟病毒石门株E2基因的4个主要抗原结构域ABCD，A1A2，B和C。分别将4个片段克隆于pMAL－p2X载体中，经PCR、双酶切和测序鉴定，E2基因的4个主要抗原结构域片段的位置、大小和读码框均正确。将4个片段分别转化到表达菌TB1、BL21、BL21－CodonPlus(DE3)-RP和BL21(DE3)中，共得到16株重组表达菌，用IPTG进行诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析。【结果】E2基因的4个主要抗原结构域均可在这4种表达菌中表达，但以BL21－CodonPlus(DE3)-RP的表达效果最好，可表达出可溶性并且产量较高的目的蛋白。免疫印迹结果表明，表达的目的蛋白可以被猪瘟阳性血清和针对E2蛋白的单克隆抗体所识别。【结论】只表达目的基因的抗原结构域，可以缩短表达片段的长度，有利于获得可溶性目的蛋白，并且具有良好的血清学反应的特异性。     

牛微小隐孢子虫子孢子表面抗原p23基因的克隆及原核表达

从已构建的牛微小隐孢子虫子孢子cDNA文库中,用PCR方法扩增出子孢子表面抗原p23基因,将其插入到编码谷胱肽转移酶(GST)的质粒(pGEX-4T-2)多克隆位点,构建原核表达载体pGEX-p23。重组质粒经EcoRI/Sal I酶切、测序鉴定后转入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达蛋白。结果成功构建了pGEX-p23原核表达载体,经IPTG诱导,转化的大肠杆菌表达出分子质量为47kDa的GST融合蛋白,且该蛋白能与抗p23抗体发生特异性结合反应。本研究为进一步研究p23的生物学功能和临床应用奠定了基础。     

猪瘟病毒p80基因丝氨酸蛋白酶功能区的原核表达及小鼠免疫试验

根据已发表的猪瘟病毒Alfort株的全基因组序列,设计2对引物以Shimen细胞毒株为材料,一步法提取总RNA,利用RT-PCR和套式PCR,成功扩增出p80全长基因,包括丝氨酸蛋白酶以及NTPase/RNA解旋酶功能区,大小约为2.0kb。将p80基因中的丝氨酸蛋白酶基因克隆到原核表达载体pET-32a中,获得重组质粒pET-p80。将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）中,IPTG诱导表达得到分子量约为43ku的目的蛋白,与理论大小相符。将菌体蛋白经Ni柱纯化,获得纯化重组p80蛋白,Western blot检测表明,表达的目的蛋白能与CSFV阳性血清发生反应。用纯化的p80蛋白免疫Bal b/c小鼠,成功制备了抗p80蛋白的抗血清。     

牛乳素Lfcin B基因的合成及其在酵母菌中的表达研究

[目的]为临床研究和治疗某些病原微生物引起的感染提供依据。[方法]参照LfcinB的氨基酸序列,利用化学合成法合成LfcinB基因并克隆到pPIC9K载体中,转化到酵母菌GS115感受态细胞中,用抗性选择标记G418筛选出高拷贝酵母菌转化子。利用甲醇诱导表达重组LfcinB,经Tricine-SDS-PAGE电泳检测目的蛋白牛乳铁蛋白素的表达情况,同时通过体外抑菌试验检测表达产物的抑菌活性。[结果]提取的酵母菌DNA扩增出1条预期的560bp左右的特异性条带。目的基因已经成功克隆到pPIC9K载体中,并转到酵母菌GS115中而且获得了表达。重组酵母表达上清中牛乳铁蛋白素抗菌肽对沙门氏肠炎杆菌的抗菌活性为42.857IU/ml,表明LfcinB基因的酵母表达载体构建成功。[结论]该研究证明利用化学合成法直接合成编码LfcinB的DNA构建真核表达载体、通过生物发酵工程来制备LfcinB是可行的。     

牛eIF5基因原核表达与蛋白纯化

研究应用PCR方法扩增牛e IF5基因编码序列,通过Eco RⅠ和SalⅠ酶切位点将其定向插入p GEX-4T-1载体,构建原核表达重组质粒p GEX-4T-1-e IF5,并转化大肠埃希菌BL21。酶切和测序鉴定正确后,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)大量诱导表达,利用GST-Sepharose 4B亲和珠纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定。结果表明,原核表达载体p GEX-4T-1-e IF5构建成功,Western Blot证实融合蛋白大量表达,纯化后获得GSTe IF5融合蛋白,为深入研究牛e IF5蛋白功能奠定基础。     

猪瘟病毒DNA疫苗的构建及动物免疫试验

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)C株E2囊膜蛋白全长基因克隆到真核表达载体pcDNA4.0的CMV启动子下游,采用磷酸钙转染法将重组质粒转入293T细胞,流式细胞仪(FACS)检测293T细胞瞬时表达了E2囊膜蛋白。将构建的重组质粒肌肉注射BALB/c小鼠,用流式细胞仪和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测证明成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体,为下一步利用DNA疫苗免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。     

重组腺病毒介导的猪瘟 E0基因在山羊乳腺中的表达

为使猪温病毒(CSFV)E0蛋白在奶山羊乳腺中得以合成和分泌,一段上游带有信号肽和His标签序列的CSFVE0基因通过腺病毒穿梭载体被插入到腺病毒质粒中,将此重组质粒转染293A细胞包装得到重组腺病毒Ad-hisE0。为证明其有效性,用Ad-hisE0感染293A细胞,实时定量PCR检测显示E0基因的表达显著提高。用Ad-hisE0分别感染牛乳腺上皮细胞和泌乳期山羊乳腺,SDS-PAGE和Western blot分析结果显示出E0蛋白分别位于26ku和48ku处的2条特异性条带。证实构建的腺病毒Ad-hisE0可以介导重组融合蛋白CSFV E0在山羊乳腺中的表达和分泌。     

鸭β-防御素9基因的克隆、组织分布及其原核表达

 【目的】从鸭组织中克隆鸭β-防御素9（AvBD9）基因,在原核表达重组鸭AvBD9蛋白;研究重组鸭AvBD9蛋白的体外抗菌活性与理化特性。【方法】采用RT-PCR法,从鸭肝脏组织中扩增鸭AvBD9基因,测定该基因在鸭各组织器官中的分布;将鸭AvBD9基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上,构建重组表达质粒pGEX-duck AvBD9,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达;亲和层析纯化蛋白,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定重组鸭AvBD9蛋白的体外抗菌活性与理化特性。【结果】从鸭肝脏组织中克隆得到鸭AvBD9基因,序列分析表明该基因大小为204 bp,前体肽包括67个氨基酸残基。AvBD9基因在鸭体内广泛分布。SDS-PAGE电泳表明鸭AvBD9基因在大肠杆菌中高效表达,表达的重组鸭AvBD9融合蛋白以包涵体的形式存在,分子量约31 kD。重组鸭AvBD9蛋白对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌有抗菌活性,在-70～100℃或pH 3～10处理30 min后仍有抗多杀性巴氏杆菌作用。【结论】鸭AvBD9基因为204 bp,编码67个氨基酸残基,在鸭组织中广泛分布。重组鸭AvBD9蛋白基因在大肠杆菌中高效表达,该重组蛋白具有广谱的抗菌活性,对温度和酸碱性有较高的稳定性。     

猪瘟病毒Shimen株p80基因的克隆及其真核表达质粒的构建

根据已发表的猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)Alfort株和Brescia株的全基因组序列,设计2对引物P1/P2和B1/B2,在B1和B2的5''端分别加上XhoI和ApaI位点,以CSFVShimen株细胞毒为材料一步法提取总RNA,并以此为模板采用反转录PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR),成功地扩增到约2.0kb的片段,将此PCR产物回收后与pMD18-T连接、转化,获得重组质粒,经PCR扩增,限制性酶切(BamhI/HindШ)和序列部分测定鉴定为阳性重组质粒P80-T。将P80-T分别经XhoI和ApaI酶切消化、回收后,与经XhoI/ApaI酶解的真核表达载体PEGPF-C1连接、转化,获得重组质粒,经PCR,XhoI和ApaI限制性酶切和序列测定鉴定为真核表达质粒P80-P,目的基因的插入位置、方向和读码框完全正确。为下一步在哺乳动物细胞中表达猪瘟病毒p80蛋白奠定了基础。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因重组杆状病毒的构建与表达

通过设计特异引物,扩增获得口蹄疫病毒3ABC编码区的目的基因片段,将其用SalI和NcoI双酶切后,与经同样处理的带有一段信号肽序列的穿梭质粒pMelBac-B连接,经筛选、鉴定及DNA序列分析后,获得重组质粒pMel-3ABC.将重组质粒与线性化的杆状病毒骨架Bac-N-Blue共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.用重组病毒感染Sf9昆虫细胞,通过间接ELISA方法,检测细胞培养基上清液中表达的口蹄疫病毒抗原.结果表明,口蹄疫病毒基因片段3ABC正确克隆到杆状病毒载体上,重组病毒可在昆虫细胞中表达目的蛋白.