猪IFN-α在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

为了获得高效抗病毒活性的猪α-干扰素蛋白,采用PCR法扩增获得猪α-干扰素基因完整的开放阅读框(ORF),构建重组表达质粒pPICZαC-IFN,电击转化毕赤酵母感受态细胞X33.挑阳性菌落诱导表达,离心取上清,SDS-PAGE和Western-blotting分析,可见1条相对分子质量约19 400的清晰蛋白条带,与理论值相符,表明表达产物为猪α-干扰素.在Vero细胞上检测该干扰素抗VSV的活性为4.04×106IU/L.     

芽孢杆菌植酸酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

根据枯草芽孢杆菌WHNB02植酸酶phyC基因全序列设计一对引物,采用PCR法从含有该基因的pUC18-phyC质粒上获得不含有信号肽序列的phyC基因表达片段,亚克隆到毕赤巴斯德表达载体pPIC9K的多克隆位点,并电转化毕赤巴斯德酵母GS115.经MD和MM平板筛选、酶活性测定,获得了阳性转化子PP9KC.首次在毕赤巴斯德酵母中实现了有生物学活性芽孢杆菌植酸酶的分泌表达,去糖基化试验表明该植酸酶的分子量为53.5 kD和50.9 kD糖基化程度不同的两种糖蛋白.用麦芽汁半合成培养基对PP9KC进行诱导培养,培养48 h后酶活可达到2453 U/mL,表达量为出发菌株的10.5倍.酶学性质分析表明,其酶促反应最适pH值为7.0,最适反应温度为65℃,经90℃处理10 min,残留酶活性为37℃时的78.2%.     

黑木耳漆酶基因在毕赤酵母中的表达及其酶学性质研究

应用SignalP 3.0 Server软件对黑木耳漆酶基因lac1(GenBank No.AY450405)编码的蛋白质序列进行分析,发现在其N端存在18个氨基酸的信号肽序列。通过RT-PCR克隆了lac1基因,分别构建带有自身信号肽的lac1基因毕赤酵母表达载体pPICN-lac1和以α因子信号肽替换自身信号肽的lac1基因毕赤酵母表达载体pPIC9-lac。将这两个载体转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115细胞,获得基因工程菌GS115-pPICN-lac1与GS115-pPIC9-lac。SDS-PAGE分析和酶活性测定结果表明,在转化后者中漆酶基因得到了有效分泌表达,而在转化前者中漆酶基因未能得到有效分泌表达。进一步研究确定GS115-pPIC9-lac菌株液体发酵的最适pH为4.0,在此发酵条件下,其分泌表达的漆酶最高酶活为0.149U·mL-1。酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH为5.0,在最适反应条件下其pH稳定性和热稳定性均较好。     

带有组氨酸标签的蛇毒基因在毕赤酵母中的表达

[目的]通过巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达带有组氨酸标签的蛇毒基因。[方法]利用基因重组技术,以海蛇基因为材料,通过PCR技术在N末端添加一个六聚组氨酸纯化标签,并将重组质粒导入菌株GS115,用1%甲醇诱导后,分泌表达了重组蛋白。[结果]测序结果显示该标签已成功插入,SDS-PAGE检测到分子量为28.5 kD的目的蛋白。[结论]成功表达了带有组氨酸标签的蛇毒蛋白,其具有良好的降纤活性。     

猪α干扰素在毕赤酵母中的分泌表达

利用PCR技术从长白猪全血基因组DNA中扩增出猪α干扰素的成熟肽(mPoIFN-α)基因,并将其亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母(Pichia pastoris)-大肠杆菌(Escherichia coli)穿梭质粒pPIC9K载体中,构建分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFN-α。将SalⅠ线性化的pPIC9K-mPoIFN-α电转化毕赤酵母GS115株(组氨酸缺陷型),使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组。转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以G418抗性梯度法筛选多拷贝重组子。该多拷贝菌株经1%甲醇诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明,猪α干扰素在毕赤酵母中成功地获得了分泌表达,并具有免疫活性,表达产物约为19kD,这为进一步研究猪α干扰素的功能奠定了基础。     

鸡β-防御素-3在毕赤酵母中的分泌表达

对鸡β-防御索-3(Gal-3)在毕赤酵母中的分泌表达进行了研究.以重组质粒CaJ-3-T为模板,利用PCR技术扩增出Gal-3基因成熟肽片段,将该片段插入到酵母表达载体pPICZα-C,构建分泌型重组表达载体pPICZα-C-Gal-3,电转入表达宿主菌X-33毕赤酵母,Zeocin抗性筛选重组菌株;挑取阳性菌株经甲醇诱导表达,Tricine-SDS-PAGE电泳发现在约4.5 kDa位置出现预期条带;对所表达的Gal-3进行抗菌活性检测,发现其具有抗大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等细黹的活性.     

猪肺炎支原体P36基因在毕赤酵母中的表达

根据GenBank中猪肺炎支原体P36基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增出猪肺炎支原体特异性蛋白基冈P36,克隆入酵母表达载体pPICZα-A,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-P36.PICZα-A-P36经Sac Ⅰ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33.PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导分泌P36蛋白于发酵卜清液中,通过SDS-PAGE电泳以及Western-blotting进行鉴定,结果表明,P36蛋白基因获得了分泌性表达,而且具有良好的反应原性,这为猪肺炎支原体免疫检测试剂盒和基因工程疫苗的研制奠定了基础.     

鸡γ干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达

为了获得高效分泌表达ChIFNγ的重组毕赤酵母菌株,利用基因工程技术,将435 bp的ChIFNγ成熟肽编码基因亚克隆到巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体PPICZαC中,将该重组质粒用BstX Ⅰ线性化并通过电击法转化毕赤酵母X-33菌株,用500 μ/mL抗生素Zeocin筛选高拷贝阳性重组菌.甲醇诱导表达的重组ChIFNγ经SDS-PAGE电泳,可在相对分子质量约2.0×104处检测到目的蛋白带,目的蛋白占酵母表达上清液总蛋白质的35％.微量细胞病变抑制法检测表达产物的生物学活性,检测结果表明,巴斯德毕赤酵母表达的重组ChIFNγ的抗病毒效价为6 400 U/mL.     

青麻epsps基因在酵母中表达

将青麻epsps基因构建到酵母胞内表达载体pPIC3.5K中,利用电转化法将构建好的表达载体转入巴斯德毕赤酵母中,PCR技术筛选出阳性转化子,证明外源epsps基因已经整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上,经诱导表达后SDS-PAGE分析获知外源基因在酵母中获得了表达。并且通过草甘膦压力筛选出耐性较好的重组酵母菌株,证明所获得的epsps基因具有生物学功能。     

毕赤酵母分泌表达SAMS及表达产物活性分析

[目的]利用毕赤酵母分泌表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）。[方法]以酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）基因组DNA为模板,通过PCR扩增出S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因2（sam2）,构建重组毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPIC9Ks-am2,转化毕赤酵母GS115,以甲醇诱导表达分泌蛋白SAM合成酶,并用HPLC测定重组蛋白的酶活力。[结果]经SDS-PAGE鉴定重组蛋白分子量约50kD,比理论值42.5 kD稍大,可能是分泌过程中糖基化等加工造成。体外酶促反应结果显示,伴随甲醇诱导及初步纯化过程的进行,蛋白活力逐步提高,纯化后比活力为61.48 U/mg。[结论]该研究首次实现了SAM合成酶的胞外表达,为开发和建立体外酶促法生产SAM工艺奠定了基础。     

毕赤巴斯德酵母表达外源蛋白研究进展

毕赤巴斯德酵母表达系统具有真核生物表达的特点 ,现已广泛用于外源蛋白的表达。本文综述了其自身的优点 ,表达载体的特点 ,外源基因拷贝数的多少与表达产量的关系 ,分泌型蛋白的表达 ,表达外源蛋白所需的外部条件以及翻译后的加工和修饰过程     

phyA基因在毕赤酵母中的表达以及表达产物的检测

对获得的植酸酶基因PhyA进行TA克隆,获质粒pTA-phyA,酶切后,使其在连接体系中连接到酵母表达载体pPIC9K-InS片段上,随后将重组质粒转化给大肠杆菌,验证其成功后,再将重组质粒转化给毕赤酵母,诱导其表达,通过测定植酸酶活性,得出其表达量。     

人源明胶基因在毕赤酵母中的表达

[目的]利用毕赤酵母重组获得明胶蛋白。[方法]构建基因工程菌,利用甲醇诱导表达。[结果]LC-MS/MS检测到了明胶蛋白。[结论]微生物重组表达特定分子量大小的明胶是可行的。     

犬α1干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒活性研究

亚克隆犬α1干扰素(CaIFN-α1)成熟蛋白编码基因并克隆到表达载体pPICZα-A,构建转移重组载体pPICZα-A-CaIFN-α。pPICZα-A-CaIFN-α经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。转化子经PCR分析鉴定后利用甘油增菌和甲醇诱导,实现了CaIFN-α1在毕赤酵母系统中的分泌表达。SDS-PAGE检测结果表明表达产物相对分子质量约为2.7×104,比其推导结果(约1.9×104)大,推测可能是发生了糖基化。酵母分泌表达的CaIFN-α1具有较高的抗病毒活性,约为1.45×106U·mL-1,蛋白含量约为96mg·L-1,比活性为1.49×107U·mg-1。重组CaIFN-α1的生物学活性具有较强的种属特异性,在犬肾细胞(MDCK)上具有很高的抗病毒活性,在鸡胚成纤维细胞上活性较低,而在猫肾细胞(F81)和牛肾细胞(MDBK)上几乎没有抗病毒活性。进一步研究发现,重组犬α1干扰素对犬瘟热病毒和伪狂犬病毒在犬肾细胞中的增殖具有显著抑制作用。     

S-腺苷甲硫氨酸合成酶在毕赤酵母中的分泌表达

S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）是甲硫氨酸（Met）的活性形式。生物体内,SAM由S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）[EC2．5．1．6]催化L．甲硫氨酸（L．Met）和A11）反应而合成。酿酒酵母细胞中有2种SAM合成酶的同工酶,即SAMS1和SAMS2,分别由基因saml和sam2编码,二者氨基酸序列的同源性高达92％。在过量L-Met存在下,saml的转录受到抑制;已有酶促法合成研究显示sam2编码的合成酶没有产物抑制现象。笔者将sam2基因连接于毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,并通过同源重组整合到酵母染色体上,以实现SAM合成酶的分泌性表达,为开发和建立酶促法生产SAM工艺奠定基础。     

猪α干扰素基因经密码子改造在毕赤酵母菌中的高效分泌表达

根据毕赤酵母Pichia pastoris表达系统对于密码子的偏嗜性,将去除信号肽的猪α干扰素(PoIFN-α)基因重新设计改造并合成一段新的核苷酸序列,置于毕赤酵母菌α因子分泌信号的DNA序列后,构建成pPICZαC-PoIFN-α分泌型重组表达载体,电转化进入野生型毕赤酵母菌X-33中,经ZeocinTM抗性筛选后...     

土曲霉植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

参考已报道的植酸酶基因phyA全序列设计一对引物,用PCR方法从土曲霉穴Aspergillusterreus雪总DNA中扩增到去除信号肽和内含子后约1.4kb的phyA基因编码区片段,对该片段进行了克隆与序列测定。进一步用该片段构建了pPIC9K-phyA分泌型表达载体,并转化毕赤酵母穴Pichiapastoris雪GS115。通过表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE电泳分析,植酸酶在重组转化子中得到了有效分泌和高效表达。摇瓶诱导发酵132h后发酵液中植酸酶的活性可达167u·mL-1;表达产物在pH2.0～8.0均有活性,最适pH为5.5,最适温度为55℃。     

猪α干扰素在毕赤酵母中的高效表达和纯化

为了研制新型的猪用抗病毒制剂,开展了猪α干扰素（PoIFNα）在毕赤酵母中的表达和产物纯化研究。将PCR扩增的PoIFNα基因插入pPIC9k的SnaBⅠ和EcoRⅠ位点,构建了表达转移载体pPIC9k/PoIFNα;经酶切和测序鉴定,转移载体构建正确。pPIC9k/PoIFNα以限制性内切酶SalⅠ线性化后电转化毕赤酵母GS115菌株,经抗性筛选获得4拷贝PoIFNα基因的重组菌株GS115/PoIFNα;重组菌株经BMMY培养基诱导后上清中有目的蛋白,表达量达136 mg/L。表达产物经过SP-Sepharose 阳离子交换层析,可以得到纯度较高的rPoIFNα,纯化产物在MDBK细胞上抑制VSV的活性高达2.27×108 U/mg。     

猪表皮生长因子在毕赤酵母中的表达及鉴定

 【目的】猪表皮生长因子（pEGF）具有刺激静止期猪卵母细胞的成熟以及刺激仔猪胃肠上皮细胞成熟的功能，从而可以提高母猪繁殖率和降低断奶仔猪的应激。因此开发猪表皮生长因子具有重要意义。【方法】用人工合成的pEGF 基因为模板，用PCR扩增获得pEGF-6His片段，将其克隆到载体pPIC9构建重组质粒pPIC9-pEGF并电转化毕赤酵母。用斑点杂交法筛选多拷贝整合转化子即基因工程菌，用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白，纯化产物用抗His-tag 的单克隆抗体进行蛋白质免疫印迹、氨基端测序鉴定、体外生物活性检测。【结果】斑点杂交法筛选中信号越强的转化子，甲醇诱导表达的目的蛋白含量越高。免疫印迹中可以观察到印迹条带。氨基端氨基酸测序发现纯化的表达产物含有2条肽链，其N-端15个氨基酸的序列分别与天然的pEGF以及Glu-Ala -pEGF的序列相同。体外生物活性检测结果表明，纯化的表达产物对BALB/c 3T3细胞具有显著的增殖作用。【结论】本研究获得了能高效表达具有生物学活性的重组猪表皮生长因子的基因工程菌。     

巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统,对Pichia pastoris基因结构、载体元件以及影响外源基因表达的因素等进行了较为全面的综述.