密码子优化烟曲霉壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达

[目的]烟曲霉(Aspergillus fumigatus)壳聚糖内切酶基因(Chitosanase,EC.3.2.1.132)(csn)的高效表达研究。[方法]根据毕赤酵母密码子的偏爱性对壳聚糖内切酶的基因进行了优化,利用连续延伸PCR方法扩增全长csn基因,构建重组质粒pPIC9k-csn,将重组质粒pPIC9k-csn线性化后转化毕赤酵母GS115,分析重组蛋白的表达,测定其酶活性,并对其酶解产物成分进行分析。[结果]实现了密码子优化后的壳聚糖内切酶的高效表达,重组菌株比野生菌株所产的壳聚糖内切酶活性提高了近20倍。[结论]该研究成功实现了烟曲霉壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达,为工业化大规模生产壳聚糖酶奠定了基础。     

内含肽-弹性蛋白介导的人溶菌酶在毕赤酵母中的表达

将人溶菌酶、内含肽、弹性蛋白3个基因串联插入巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC-MIELYZ,经Pme I酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,经G418筛选阳性克隆,并用甲醇诱导表达,以探讨内含肽-弹性蛋白介导的人溶菌酶在毕赤酵母中的表达情况。结果表明:SDS-PAGE和Western blot证实表达的融合蛋白分子量正确,抑菌试验表明融合蛋白对微球菌具有良好的抑菌效果。说明融合基因在毕赤酵母中成功表达,为后继的纯化工作及新型毕赤酵母表达载体的构建奠定基础。     

鸡γ干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达

为了获得高效分泌表达ChIFNγ的重组毕赤酵母菌株,利用基因工程技术,将435 bp的ChIFNγ成熟肽编码基因亚克隆到巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体PPICZαC中,将该重组质粒用BstX Ⅰ线性化并通过电击法转化毕赤酵母X-33菌株,用500 μ/mL抗生素Zeocin筛选高拷贝阳性重组菌.甲醇诱导表达的重组ChIFNγ经SDS-PAGE电泳,可在相对分子质量约2.0×104处检测到目的蛋白带,目的蛋白占酵母表达上清液总蛋白质的35％.微量细胞病变抑制法检测表达产物的生物学活性,检测结果表明,巴斯德毕赤酵母表达的重组ChIFNγ的抗病毒效价为6 400 U/mL.     

鸡源志贺菌IpaC基因表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

为使IpaC基因表达产物保持天然的生物学活性,实现在酵母表达系统中高效表达,本研究在不改变IpaC蛋白氨基酸序列的情况下,根据酵母密码子偏爱性优化合成IpaC#基因,分别构建真核表达载体pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#,然后将线性化重组质粒电转化至毕赤酵母X-33中,对阳性转化子用SDS-PAGE及Westernblot检测其表达产物。结果表明,经SDS-PAGE及Westernblot检测,仅在pGAPZαA-IpaC#/X-33重组菌表达产物菌体沉淀中检测到大小为70ku的目的蛋白,实现了鸡源志贺菌IpaC#基因在毕赤酵母中的胞内表达,从而验证毕赤酵母表达系统与外源基因序列的相关性,为进一步提高鸡源志贺菌IpaC基因在毕赤酵母中的高效表达提供科学依据,对研究该病的发病机制具有重要意义。     

乳酪蛋白源抗高血压活性肽的制备及其生理活性

本文研究乳酪蛋白源抗高血压活性肽(Antihypertensive peptides of casein)的制备及其在体内与体外对高血压的影响.乳源酪蛋白酶解产物经过大孔树脂DA201C脱盐处理,并采用RP-HPLC的分离纯化,检测了脱盐酶解产物与活性肽产物对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制活性,并用活性肽产品与酶解物灌胃SHR,观察SHR血压的影响.结果显示,活性肽(02mg·mL-1)与酶解产物(1 mg·mL-1)对ACE的活性有很强的抑制作用,抑制率分别为75.5%、80.1%;活性肽(5 mg·kg-1)与酶解产物(500mg·kg-1)均对自发性高血压大鼠(SHR)有较显著的降血压作用.     

昆虫抗真菌肽基因的分泌型表达及活性鉴定

 【目的】黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)抗真菌肽Drosomycin (Drs)及其同系物Drosomycin-like C (Drs-lC)和斑腹刺螠蝽(Podisus maculiverntris)抗真菌肽Thanatin对丝状真菌具有广谱高效的抑杀作用。实现抗真菌肽基因在酵母中的高效分泌型表达，对探讨利用转基因酵母的发酵液直接进行果蔬、食品和农产品防腐保鲜的生物技术研发有重要意义。【方法】将Drosomycin基因（Drs）及其同系物基因Drs-lC和Thanatin基因分别与酵母分泌型表达载体pPICZαA重组，构建成重组表达质粒pPICZαA-Drs、pPICZαA-Drs-lC和pPICZαA–Thanatin。利用电转化将重组质粒转化毕赤酵母GS115，经表型筛选和PCR鉴定获得的重组毕赤酵母转化子，在甲醇诱导下进行抗真菌肽的分泌表达。【结果】3种抗真菌肽基因的酵母表达产物对6个供试真菌中的5个有明显的抑制作用，Thanatin同时对供试细菌有抗菌活性。【结论】Drs、Drs-lC和Thanatin抗真菌肽基因成功地转化毕赤酵母，并实现其分泌型表达。     

番鸭呼肠孤病毒MW9710株δC蛋白基因在毕赤酵母中表达

将番鸭呼肠孤病毒MW9710株的σC蛋白基因与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9Kσ-C,转化大肠杆菌DH5α,经PCR、酶切和测序鉴定,基因序列完全正确。纯化的重组质粒pPIC9Kσ-C用内切酶SacⅠ线性化,电转化毕赤酵母,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合,采用G418抗性梯度法筛选多拷贝重组菌株,用甲醇进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western-blot分析表达产物,结果表明目的蛋白得到了高效表达,并且具有免疫反应性。     

枯草芽孢杆菌B111中性蛋白酶基因BS2在毕赤酵母中的表达

 【目的】为开发抗病基因和生物农药新资源,纯化鉴定枯草芽孢杆菌B111分泌的抗棉花黄萎病菌蛋白质,克隆其编码基因,并分析在毕赤酵母中的表达特性。【方法】通过超滤浓缩、90%硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶QAE-A50强阴离子交换柱洗脱及冻干等步骤,分离纯化抗菌蛋白。采用联机反相毛细管柱液相色谱电喷雾串联质谱,鉴定抗菌蛋白种类。克隆包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因序列,构建表达载体pPIC9K-PT,转化毕赤酵母GS115。转化子经PCR鉴定,甲醇诱导表达产物经中性蛋白酶活性和抗菌活性检测验证功能。【结果】纯化鉴定了一个来源于枯草芽孢杆菌B111的抗菌中性蛋白酶BS2。克隆了包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因BS2,并在毕赤酵母中获得有效表达。重组BS2蛋白分子量约69 kD,表达水平29.77 mg?L-1,水解酪素酶活力27 800 U?g-1,并显示抗黄萎病菌活性。【结论】纯化鉴定了一个具有抗菌活性的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶BS2,克隆其编码基因BS2,并成功实现在酵母中的有效表达。     

家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace在毕赤酵母GS115中的表达及其分析

【目的】构建表达家蚕乙酰胆碱酯酶（BmAChE）的毕赤酵母菌株,实现BmAChE在毕赤酵母中分泌表达并对其活性进行分析。【方法】从家蚕头部提取总RNA,经RT-PCR反转录成cDNA,通过PCR扩增出家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace并进行序列测定。采用PCR及重叠延伸PCR去除原bmace中的信号肽和疏水肽,并对序列中存在的2个A+T富含区进行同义密码子替换的改造。将改造后的bmace与表达载体pPIC9K连接,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白,以Ellman法测定酶活力,毒扁豆碱和有机磷及氨基甲酸酯类农药抑制试验分析重组BmAChE（rBmAChE）的生物活性。【结果】改造后的bmace经重组毕赤酵母菌株分泌表达了1个分子量约为70 kD的蛋白,具有AChE活性,酶比活力约为1 187 U•mg-1。抑制试验显示,该rBmAChE能够被毒扁豆碱强烈抑制,并且可被皮蝇磷等10种有机磷农药和克百威等5种氨基甲酸酯类农药抑制,最低抑制浓度IC50值可达2.78×10-10 mol•L-1。【结论】成功构建分泌表达BmAChE的毕赤酵母菌株,其表达了具有良好活性的rBmAChE,可用于进一步制备有机磷及氨基甲酸酯类农药快速检测分析制剂。     

高比活木聚糖酶XYN-W及其突变体在酵母中的高效表达

将来源于瘤胃真菌Neocallimastix frontalis的高比活木聚糖酶基因xyn-w整合到毕赤酵母表达载体pPIC9上,通过电击转化得到重组转化子。SDS-PAGE分析和表达产物的研究表明,木聚糖酶基因xyn-w得到了高效分泌表达,在5 L发酵罐中木聚糖酶蛋白表达量达到1 mg/mL,酶活性达到13 000 IU以上。XYN-W 的C端57个氨基酸序列为连接序列和锚定区域,利用PCR方法将此段序列去除,得到截短的木聚糖酶序列xyn-m。用相同方法构建高效表达XYN-M蛋白的毕赤酵母工程菌株,表达产物经纯化后进行酶学性质测定, 结果表明, 其比活为19 856.6 IU/mg, Kcat值为4 433.8 s-1,与纯化的XYN-W蛋白(比活性13 795.3 IU/mg、Kcat值2 717.1 s-1)相比,分别提高了43.9%和63.2％。     

发酵牛肉火腿中ACE抑制肽的稳定性研究

研究了发酵牛肉火腿中提取的ACE抑制肽的热处理、室温储存和模拟胃肠道消化稳定性。结果表明,发酵牛肉火腿中提取的ACE抑制肽,在50、72、85和100℃下处理5 min和100℃下5、10、20和40 min处理后,处理组和对照组ACE抑制活性无显著差异。在室温下储存2 d,处理组和对照组ACE抑制活性无显著差异(P0.05),但储存至3 d,它的ACE抑制活性显著低于对照组(P0.05),其后储藏时间对提取物的ACE抑制活性无显著影响。ACE抑制肽经体外模拟胃肠道消化后,其活性与对照组无显著差异。     

胃-胰蛋白酶水解蜂王浆主蛋白制备血管紧张素转化酶抑制肽工艺的优化

采用胃-胰蛋白酶水解蜂王浆主蛋白(MRJPs),对底物浓度、pH值、酶作用时间和蛋白酶浓度对水解效果的影响进行单因素分析,然后通过正交试验对胃-胰蛋白酶共同作用的酶解工艺进行优化;最后采用超滤分离技术对王浆主蛋白水解产物(H-MRJPs)进行分离,以制备血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽。结果表明:优化的酶解工艺为37℃恒温、质量比为1%的胃蛋白酶(pH=2.0)和胰蛋白酶(pH=7.5)各水解2h;在最佳工艺条件下,MRJPs水解度为28.7%,总氮回收率为35.5%;通过SDS-PAGE电泳未检测到MRJPs水解产物(H-MRJPs)含有明显的蛋白条带;采用超滤法对H-MRJPs分离得到分子质量范围为<1、1～5和>5ku的3类血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,其ACE半抑制质量浓度(IC50)分别为0.33、0.61和1.09mg.mL-1,即以分子质量<1ku的产物活性最强。该结果为利用王浆主蛋白开发降压功能食品提供了科学依据。     

挤压协同酶法制备高粱蛋白ACE抑制肽及其稳定性

【目的】 利用挤压协同酶法制备高粱蛋白ACE抑制肽,为提高高粱蛋白资源的利用效率提供参考。【方法】 以高粱粉为原料,先经挤压处理,再经淀粉酶酶解,最后通过碱性蛋白酶酶解,获得高粱蛋白ACE抑制肽。研究物料水分、挤压温度和淀粉酶活力对高粱蛋白酶解液的水解度和ACE抑制活性的影响,并探讨高粱蛋白ACE抑制肽的稳定性。【结果】 随着物料水分含量和挤压温度的增加,挤压过程中单位机械能耗（SME）逐渐降低。在挤压环境下,高粱中淀粉和蛋白质的相互结合变得松散,淀粉-蛋白质包埋体系被破坏;同时高粱中球形蛋白质体被打破,提高所获得高粱蛋白的酶敏感性,在碱性蛋白酶的作用下生成更多具有抑制活性的短肽。挤压过程中物料水分含量和挤压温度以及α-淀粉酶活力对高粱蛋白酶解液的水解度和ACE抑制率有显著影响。随着物料水分的增加,蛋白质分子的聚合程度下降,使得高粱蛋白酶解液的水解度和ACE抑制率随之增加,当物料水分增加至19%后,挤压过程对蛋白质周围的淀粉分子的破坏作用降低,水解度和ACE抑制率的上升趋势趋于平缓;当挤压温度从120℃增加至180℃时,高粱内部的蛋白质-淀粉包埋体系破坏加剧,同时蛋白质的空间结构在高温作用下的变性程度加大,高粱蛋白酶解液的水解度由7.42%增加至11.06%,同时高粱蛋白ACE抑制肽的抑制率也由46.57%增加至53.41%;挤压后高粱粉经α-淀粉酶处理,进一步去除包裹在蛋白质周围的淀粉,发现随着α-淀粉酶活力的增加,高粱内部的蛋白质-淀粉包埋体系破坏程度加剧,为制备高粱蛋白ACE抑制肽提供更多原料,导致高粱蛋白酶解液的水解度和ACE抑制率随之增加,当α-淀粉酶活力增加至2.0 U·g ^-1时,淀粉酶与淀粉结合达到饱和状态,水解度和ACE抑制率趋于稳定。高粱蛋白ACE抑制肽经温度和酸碱处理后,ACE抑制活性在68.1%—71.31%,保持了良好的抑制活性;高粱蛋白ACE抑制肽在体外经胃肠道酶系消化酶解后,ACE抑制活性均高于73%,依然保持了较强的ACE抑制活性,说明挤压协同酶法制备的高粱蛋白ACE抑制肽具有长期保存有效性,同时能够在胃肠道消化后保持生物活性。 【结论】 采用挤压协同酶法可以显著提高高粱蛋白酶解液的水解度和ACE抑制肽的活性,同时制备的高粱蛋白ACE抑制肽具有良好的稳定性,为拓宽高粱的利用和制备功能性食品配料提供了一条新途径。     

透明颤菌血红蛋白对毕赤酵母菌体密度及表达的影响

将提高菌体发酵密度的透明颤菌血红蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn共同克隆进巴斯德毕赤酵母的分泌型表达载体pPIC9K而设计了重组质粒pPIC9K-vgbbxn,其中vgb胞内表达以提高菌体的发酵密度,bxn分泌表达.转化GS115菌株后,通过PCR、SDS-PAGE检测证实两基因已经整合进酵母基因组且能高效表达,摇瓶发酵试验证明,血红蛋白在贫氧条件下可明显促进酵母菌体生长和bxn基因分泌表达.     

鸡α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达、纯化及其抗病毒活性测定

本试验将已构建的鸡α-干扰素重组酵母表达质粒pPIC-ChIFNα克隆至Pichia pastorisGS115基因组中,从阳性转化子中筛选出2株能高效表达鸡α-干扰素的重组酵母菌株,并对表达产物进行了纯化和抗病毒活性的测定。结果表明,Pichia pastoris表达的重组ChIFNα具有较高的抗病毒活性,其活性单位为570×104U/ml,结合蛋白定量计算其比活性为2 980×104U/mg。     

米黑根毛霉脂肪酶基因密码子优化及重叠延伸PCR合成

[目的]对米黑根毛霉脂肪酶基因的密码子进行优化,并采用重叠延伸PCR合成设计的基因序列。[方法]根据毕赤酵母(Pichiapastoris)密码子使用偏好性,对米黑根毛霉脂肪酶成熟肽基因进行全面密码子优化,根据优化后的氨基酸编码序列设计合成30条长度约为48 bp的寡核苷酸片段,并采用重叠延伸PCR法扩增合成全长基因序列。[结果]经凝胶电泳和酶切鉴定、测序分析表明,合成的目的基因与设计的序列相一致。[结论]该研究为脂肪酶基因在毕赤酵母中的构建及后续表达奠定了基础。     

牦牛IFN-β基因在毕赤酵母中的分泌表达

用真核表达引物从pGEM-yakIFN-β重组质粒中扩增出牦牛IFN-β基因,将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E.coli的JM109中,得到pPIC9K-yakIFN-β重组表达质粒.通过电击法将经SalⅠ线性化的pPIC9K-yakIFN-β质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中,采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,利用甲醇诱导表达,分泌表达产物用MTT法检测其生物学活性.经SDS-PAGE电泳分析表明:表达出约22ku大小分泌于胞外的牦牛IFN-β蛋白分子量,比理论值稍大;MTT结果表明:纯化的重组yak-IFN-β蛋白具有促进淋巴细胞增殖的活性.     

O型口蹄疫病毒VP1-2A基因及多表位片段在毕赤酵母中的表达

利用毕赤酵母表达系统串联表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1-2A基因及O型FMDV多表位片段(CTE),将O型FMDVvp1基因和CTE多表位片段克隆到毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-VP1-2A-CTE并测序。经SalI线性化后,通过电击转化法将重组质粒导入毕赤酵母GS115中,并对表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。重组质粒通过电转进入毕赤酵母后,能表达相对分子量为41.8KD(CTE)和26.5KD(VP1-2A)的蛋白,经Western blot分析,两种蛋白均具有抗原性。在毕赤酵母中成功地表达O型FMDVVP1-2A蛋白和多表位片段(CTE),为研制新型口蹄疫的基因工程疫苗奠定了基础。