来源于云斑天牛肠道细菌Pseudomonas sp. TN06的β-折叠桶植酸酶基因phyA06的克隆、表达和酶学性质研究

从云斑天牛肠道中筛选到一株产植酸酶活性较高的假单胞菌Pseudomonas sp.TN06。采用简并PCR和TAIL-PCR的方法获得一个新的β-折叠桶植酸酶基因(phyA06),开放阅读框全长1 902 bp,编码633个氨基酸和1个终止密码子,预测其前23个氨基酸为信号肽,含有两个β-折叠桶结构域。将phyA06基因在大肠杆菌中表达,重组蛋白经镍柱纯化后达到电泳纯。纯化后的重组酶最适pH为7.0,在pH 6.0~10.0的条件下具有很好的稳定性;最适温度为55℃,热稳定性良好。同时,该酶在低温下仍保持一定活力,甚至0℃仍有活性。该植酸酶具有应用于水产饲料行业的潜在价值。     

新型高产β-胡萝卜素巴斯德毕赤酵母表达宿主菌的构建

分泌型巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）作为高效表达宿主菌已被广泛应用,通过高密度培养工艺用于多种酶制剂(如植酸酶、甘露聚糖酶等)的规模生产。然而,在生产过程中产生的大量菌体利用率低,多数被废弃掩埋,或只能作为廉价的菌体蛋白,造成大量的资源浪费。为提高酵母发酵副产物的利用率,向毕赤酵母宿主菌GS115中导入来源于红发夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）β-胡萝卜素合成途径中的关键基因(idi、crtE、crtYB和crtI),获得了胞内高产β-胡萝卜素的工程菌株P. pastoris GS115-CARO,实现工业生产中的菌体蛋白的高附加值利用。同时以来源于嗜热篮状菌（Talaromyces leycettanus JCM12802）的甘露聚糖酶基因Man5T作为参照,验证了宿主菌P. pastoris GS115和P. pastoris GS115-CARO在表达外源蛋白的差异。结果表明：Man5T基因的导入并没有影响,两株宿主菌的甘露聚糖酶表达量（分别为280 U/mL和286 U/mL,P>005）,但宿主菌P. pastoris GS115-CARO胞内β-胡萝卜素产量高达到31.27 mg/g(菌体干重dry cell weight,dcw)。构建的工程菌株不仅可以实现外源酶制剂的高效表达,有效地提升酵母菌体资源的利用价值,同时也在一定程度上了解决了发酵菌体对环境的污染问题。     

低纤维素酶背景里氏木霉菌株的构建和应用

丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）产生的纤维素酶主要包括纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。在使用里氏木霉表达外源基因时,它们会形成较高的纤维素酶背景,而且其表达还可能会导致对细胞转录、翻译和分泌等相关资源的占用。应用CRISPR/Cas9技术,在体外组装Cas9/gRNA复合物并转化里氏木霉以定点敲除主要的纤维二糖水解酶cbh1基因,同时结合RNAi干扰技术来沉默主要的内切葡聚糖酶eg2基因,以期一步构建里氏木霉低纤维素酶背景的表达系统。获得了一株纤维素酶表达显著下降的11号转化子SUS6。该转化子中,cbh1的表达完全消失,而eg2基因的表达水平较出发菌株SUS5降低了98%。以该转化子为宿主表达外源基因NfBgl3A,两个代表性转化子的β-葡萄糖苷酶酶活最高分别为172.4和79.3 U·mL^-1,远高于以出发菌株（高纤维素酶背景）为宿主表达β-葡萄糖苷酶酶活（两个代表转化子分别为11.6和31.9 U·mL^-1）。因此,构建低纤维素酶背景的菌株作为表达宿主,还可明显的提高某些异源基因的表达水平。     

嗜热真菌Neosartorya fischeri P1脂肪酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

从云南酸矿废水中获得了一株脂肪酶活性较高的嗜热真菌,经显微形态及转录间隔区（ITS）序列分析鉴定为新萨托菌,命名为Neosartorya fischeri P1。通过同源克隆,从该真菌中获得了脂肪酶基因Lip024,并在Escherichia coli BL21 (DE3) 和Pichia pastoris GS115 中进行表达,表达量分别为0.09 U/mL、0.26 U/mL。重组酵母菌株在3.7L发酵罐进行高密度发酵后,重组酶酶活达5.22 U/mL。重组蛋白经超滤浓缩和阴离子交换柱纯化后达到电泳纯。重组酶酶学性质分析表明：该酶的最适pH为7.0,在pH 3.0~7.0的范围内非常稳定,酶活力均保持在95%以上;最适温度为50℃,并具有一定的热稳定性。此外,Ca2+和Mg2+能够显著提高Lip024重组脂肪酶的酶活。     

绵羊瘤胃细菌阿拉伯糖异构酶基因多样性的初步研究

L-阿拉伯糖异构酶可以催化醛酮糖的异构化反应,将D-半乳糖转化为D-塔格糖,从而在动物营养与食品应用研究中获得重视。动物瘤胃是一个特殊的厌氧环境,而瘤胃微生物含有大量的多糖降解酶的新颖基因。初步分析了绵羊瘤胃液中细菌来源的阿拉伯糖异构酶基因的多样性。以饲喂后4h的瘤胃液的宏基因组为模板,通过兼并PCR技术和内切酶方法获得了61条与已知序列相似性达68%~98%的阿拉伯糖异构酶基因片段,并对38条差异片断(相似性低于95%)进行聚类分析。结果表明普雷氏菌来源的L-阿拉伯糖异构酶基因在绵羊瘤胃中占有绝对优势(36/38), 而来自于Catonella morbi和Marinilabilia salmonicolor的L-阿拉伯糖异构酶基因则数量稀少(2/38)。研究结果不但丰富了L-阿拉伯糖异构酶的基因资源,并确定了普雷氏菌在绵羊瘤胃的重要性。     

低纤维素酶背景里氏木霉菌株的构建和应用

丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）产生的纤维素酶主要包括纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。在使用里氏木霉表达外源基因时，它们会形成较高的纤维素酶背景，而且其表达还可能会导致对细胞转录、翻译和分泌等相关资源的占用。应用CRISPR/Cas9技术，在体外组装Cas9/gRNA复合物并转化里氏木霉以定点敲除主要的纤维二糖水解酶cbh1基因，同时结合RNAi干扰技术来沉默主要的内切葡聚糖酶eg2基因，以期一步构建里氏木霉低纤维素酶背景的表达系统。获得了一株纤维素酶表达显著下降的11号转化子SUS6。该转化子中，cbh1的表达完全消失，而eg2基因的表达水平较出发菌株SUS5降低了98%。以该转化子为宿主表达外源基因NfBgl3A，两个代表性转化子的β-葡萄糖苷酶酶活最高分别为172.4和79.3 U·mL^-1，远高于以出发菌株（高纤维素酶背景）为宿主表达β-葡萄糖苷酶酶活（两个代表转化子分别为11.6和31.9 U·mL^-1）。因此，构建低纤维素酶背景的菌株作为表达宿主，还可明显的提高某些异源基因的表达水平。     

利用透明颤菌血红蛋白在低氧条件下提高毕赤酵母中植酸酶的表达

为了提高毕赤酵母(Pichia pastoris)中重组植酸酶的表达,在来源于Pichia stipitis的低氧诱导启动子PsADH2控制下,进行了透明颤菌血红蛋     

高比活木聚糖酶XYN-W及其突变体在酵母中的高效表达

将来源于瘤胃真菌Neocallimastix frontalis的高比活木聚糖酶基因xyn-w整合到毕赤酵母表达载体pPIC9上,通过电击转化得到重组转化子。SDS-PAGE分析和表达产物的研究表明,木聚糖酶基因xyn-w得到了高效分泌表达,在5 L发酵罐中木聚糖酶蛋白表达量达到1 mg/mL,酶活性达到13 000 IU以上。XYN-W 的C端57个氨基酸序列为连接序列和锚定区域,利用PCR方法将此段序列去除,得到截短的木聚糖酶序列xyn-m。用相同方法构建高效表达XYN-M蛋白的毕赤酵母工程菌株,表达产物经纯化后进行酶学性质测定, 结果表明, 其比活为19 856.6 IU/mg, Kcat值为4 433.8 s-1,与纯化的XYN-W蛋白(比活性13 795.3 IU/mg、Kcat值2 717.1 s-1)相比,分别提高了43.9%和63.2％。     

植酸酶发展现状和研究趋势

植酸酶作为一种新型的饲料添加剂已经得到越来越多的重视和应用。其可以提高饲料中磷和其他成分的利用率,并减轻环境污染。综述了新型酶制剂的筛选、高效表达和应用等方面的进展,并对进一步的研究开发趋势进行了分析。