鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因植物表达载体的构建

以含鸡传染性法氏囊病病毒(杭州分离株,HZ96)VP2基因的质粒 PBS为模板,根据其序列设计引物进行PCR扩增,得到1.5 kb左右长的VP2基因产物;用KpnⅠ和 SalⅠ酶切纯化的PCR产物;将纯化的酶切产物在 T4 DNA连接酶的作用下定向克隆到植物表达载体Cambia1301 水稻胚乳特异性启动子GT1下游, 并经PCR、酶切和测序鉴定.植物重组表达载体经三亲交配已导入根癌农杆菌中.     

A型口蹄疫病毒VP3基因的克隆及原核表达

从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT- PCR获得cDNA.并根据FM-DV全基因组序列设计了1对针对VP3基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP3并亚克隆入pMD 18-T载体.将鉴定出的阳性质粒和表达载体PET32a用BamH Ⅰ、HindⅢ双酶切回收后连接,获得阳性重组质粒PET32-VP3.用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP3,并用SDS - PAGE进行检测,表达产物用镍亲和树脂进行纯化.结果证明口蹄疫病毒VP3蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步研究提供了重要的材料.     

禽传染性支气管炎病毒S1基因植物表达载体的构建

以含传染性支气管炎病毒（ZJ971毒株）S1基因的质粒PBS为模板,根据其序列设计引物进行PCR扩增,得到1.7kb左右的S1基因产物；用XbalI和BamHI酶切纯化，并在T4DNA连接酶的作用下，定向克隆到植物表达载体PBI121中,PCR及酶切鉴定表明，质粒经三亲交配已导入根癌农杆菌中。     

采用PCR-RFLP法鉴别IBDV强毒BC6/85株和弱毒B87株

选取传染性法氏囊病病毒(IBDV)强毒力代表株BC6/85和弱毒力代表株B87为研究对象,根据VP2基因保守区设计一对通用引物和两个限制性内切酶位点,分别扩增两个毒株的VP2基因,然后进行BamHⅠ和PstⅠ酶切,采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)分析酶切产物,并进行特异性、敏感性和重复性检测.结果表明:所设计的引物均可扩增两个毒株的VP2基因,大小约856 bp;经BamHⅠ和PstⅠ酶切后,BC6/85株的PCR产物被BamHⅠ和PstⅠ切出166、242和449 bp大小的3个片段,而B87株仅被PstⅠ切出242和615 bp大小的2个片段,且重复性好,特异性强.可见,采用PCR-RFLP分析IBDV VP2基因的方法操作简单,是一种能够快速鉴别IBDV强、弱毒株的可靠方法.     

犬细小病毒VP_2基因原核表达载体的构建与分析

从犬细小病毒/犬瘟热进口二联苗中提取犬细小病毒基因组DNA,以此为模板进行PCR扩增,PCR产物经BamH I和XhoI双酶切后,克隆至pET22b(+)质粒的相应位点上,构建了原核表达载体pET22b/VP2.重组质粒经限制性内切酶酶切和核苷酸序列分析表明,VP2基因已正确克隆到pET22b(+)载体上,从而成功地构建了pET22b/VP2表达载体.     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因在昆虫细胞中的表达

根据Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-I)基因组序列设计并合成一对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增DHV-I(A66株)VP1基因。用限制性内切酶EcoRⅠ/HindⅢ消化VP1基因和转移载体pFastbacⅠ,在T4DNA连接酶作用下将二者连接构建转移质粒pFastbac-VP1。经PCR、双酶切及测序鉴定后将其转化至含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10bac中,蓝白斑筛选获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-VP1,在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf 9,获得重组杆状病毒rvBac-VP1。SDS-PAGE分析结果表明,VP1基因在昆虫细胞中获得表达,表达产物分子量约为2.7×104。Western-blot检测结果表明,表达产物能与抗DHV-I阳性血清发生反应,具有良好的反应原性。     

鹅细小病毒延边株VP3基因真核表达质粒构建

用碱裂解法对鹅细小病毒延边分离株进行GPV基因组DNA提取.根据已发表的鹅细小病毒VP3基因序列,设计1对含有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点的引物,以GPV基因组DNA为模板,应用PCR扩增出VP3基因片段,将VP3基因与克隆载体pMD 18-T连接,转化到感受态大肠杆菌BL21中进行克隆.用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切该片段并回收该片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pVAXI真核表达载体中,获得重组质粒pVAXI-VP3,经PCR鉴定,限制性内切酶双酶切分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性.     

Bt基因介导的大豆抗蚜虫表达载体的构建

[目的]构建用于大豆抗蚜虫研究的Bt基因介导的Cry1Ac植物表达载体。[方法]以含有Cry1Ac的质粒pRH201为模板进行PCR扩增,将PCR产物克隆至载体质粒pBS中,将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,并对重组质粒进行酶切和测序鉴定。经验证的Cry1A基因扩增产物双酶切后与pBI121载体连接转化,挑取重组子pBIC121进行BamHⅠ／SnaBⅠ双酶切鉴定。[结果]从pRH201质粒中扩增获得长约3．5kb的Cry1Ac基因序列,对重组质粒pBSCRY的插入片段进行测定,确定了CrylAc片段的全长为3534bp,共编码1176个氨基酸。[结论]构建了Cry1A基因的植物表达载体,为大豆抗蚜虫转基因研究奠定了基础。     

缺失GDD保守区的黄瓜花叶病毒复制酶基因的克隆及植物表达载体构建

以CMV亚组1株系Fny-CMV RNA2基因组为模板,根据其序列设计引物进行PCR扩增,得到2.5 kb的全长复制酶基因扩增产物.对此产物进行纯化,并用NcoI和BspHI进行双酶切,得到3个片段,将不含有GDD保守区的2个片段用T4 DNA连接酶连接,并对连接产物进行PCR扩增,得到2.2kb左右缺失GDD保守区的黄瓜花叶病毒复制酶基因的扩增产物.将其克隆到pGEM-T Easy Vector上,进行序列测定,结果表明GDD保守区确已缺失.该缺失不导致开放阅读框架的移码将缺失GID保守区的基因定向克隆到植物表达载体pBI121中,并经三亲交配导入根癌农杆菌中,经PCR及酶切鉴定,证实质粒已被导入.     

酵母海藻糖合成酶基因植物表达载体的构建与转化

以从原核表达载体中酶切得到的tps1基因为模板，设计适当的引物，利用PCR技术，克隆出大约1．5kb的片段．PCR产物经回收后，与Pc^CAMBIA1303连接并转化大肠杆菌DH5α，阳性重组子经PCR鉴定，表明已获得海藻糖磷酸合成酶基因的植物表达载体．用基因抢转化小麦幼胚，经组织培养得到了含有海藻糖合成酶基因的小麦植株．     

猪α干扰素在毕赤酵母中的高效表达和纯化

为了研制新型的猪用抗病毒制剂,开展了猪α干扰素（PoIFNα）在毕赤酵母中的表达和产物纯化研究。将PCR扩增的PoIFNα基因插入pPIC9k的SnaBⅠ和EcoRⅠ位点,构建了表达转移载体pPIC9k/PoIFNα;经酶切和测序鉴定,转移载体构建正确。pPIC9k/PoIFNα以限制性内切酶SalⅠ线性化后电转化毕赤酵母GS115菌株,经抗性筛选获得4拷贝PoIFNα基因的重组菌株GS115/PoIFNα;重组菌株经BMMY培养基诱导后上清中有目的蛋白,表达量达136 mg/L。表达产物经过SP-Sepharose 阳离子交换层析,可以得到纯度较高的rPoIFNα,纯化产物在MDBK细胞上抑制VSV的活性高达2.27×108 U/mg。     

猪2型圆环病毒间接ELISA检测方法研究

应用PCR扩增得到猪2型圆环病毒ORF2基因的3′端约600 bp,该PCV2 ORF2基因已去除终止子,并分别在其上下游添加Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点。PCR产物用Kpn Ⅰ和 Hind Ⅲ酶切后,与经同样处理过的 pBAD/g Ⅲ B Vector连接,转化TOP10细胞后挑取阳性克隆,经酶切鉴定和测序验证后用L-arabinose诱导进行融合表达,表达的蛋白主要以包涵体存在。经过镍离子亲和层析柱纯化,SDS-PAGE显示1条约28 ku的目的条带, 纯度达到85％以上。以该28 ku的多肽包被酶标板,建立了PCV2的间接ELISA检测方法。     

番鸭源禽1型副黏病毒HN基因主要抗原结构域和V基因融合表达载体的构建

为构建番鸭源禽1型副黏病毒HN主要抗原结构域(HNd)和V基因融合表达载体,经PCR及融合PCR分别从重组质粒pMDHN和pMDP中扩增HN基因主要结构域和V基因cDNA.将HNd经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切、V基因用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,分别定向插入真核载体pcDNA3的多克隆位点相应的酶切位点中,对2个单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV进行酶切和测序鉴定.利用融合PCR技术扩增出HNd-V基因,定向克隆至pcDNA3的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切酶切位点之间,转化感受态细胞后,经PCR反应初筛后,对阳性克隆进行酶切分析及测序鉴定.对单表达重组质粒进行酶切分析及测序鉴定,结果表明:HNd和V基因已被正确定向克隆至真核表达载体peDNA3,成功构建了2个基因的单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV;对融合重组质粒酶切分析和测序鉴定表明,HNd-V融合基因正确克隆进真核表达质粒pcDNA3中,成功构建了融合表达载体pcDNAHNd-V.     

MsChiⅠ基因植物表达载体的构建及烟草转化

为提高紫花苜蓿的抗根腐病性能,采用限制性内切酶(NcoⅠ和SpeⅠ)双酶切法,双酶切重组MsChi-pMD18-T质粒和表达载体PCAMBIA1302后,将MsChiⅠ基因与线性表达载体PCAMBIA1302进行定向连接,通过酶切和PCR验证MsChi-pCAMBIA1302载体构建正确性.采用快速冻融法,将表达栽体导入根癌农杆菌LBA4404中,转化烟草植株,对转化后的烟草植株进行PCR和RT-PCR检测.结果表明:成功构建Ⅰ类几丁质酶基因MsChiⅠ的植物表达载体MsChi-pCAMBIA1302,转化获得6株烟草转基因植株,目的基因已经成功整合到烟草的基因组中.     

猪轮状病毒VP7蛋白在E.coli中的表达纯化

为制备猪轮状病毒VP7蛋白的多抗,构建大肠杆菌表达载体pQE-30-VP7,表达猪轮状病毒VP7蛋白,纯化重组蛋白VP7并对其进行鉴定。利用RT-PCR方法扩增出猪轮状病毒VP7全长基因1062 bp,克隆到pMD18-T载体中,利用SalⅠ和HindⅢ消化重组DNA进行酶切鉴定,定向克隆到表达载体pQE-30中,转化E.coli BL21(DE3)株,经PCR和酶切鉴定阳性质粒,经IPTG(终浓度为1 mmo L·L-1)37℃进行诱导,Western blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的反应原性。酶切和序列表明成功构建原核表达系统,重组大肠杆菌经IPTG诱导后,我们发现该重组蛋白主要以包涵体形式存在于细菌中,大小约为43 KDa,Western blot和间接免疫荧光分析表明该VP7重组蛋白可与Po RV阳性血清发生了特异性反应。     

限制性外切酶Ⅰ(EXO1)的合成、克隆与表达

[目的]核酸外切酶I (Exonuclease 1,EXO1)是一种多功能的3’→5’外切酶,主要应用于清除DNA或RNA双链分子中存在的单链。目前商品化的EXO1都是在大肠杆菌中诱导表达,表达量不高,且后续纯化步骤复杂。人工合成核酸外切酶ⅠsbcB基因,并在大肠杆菌中高效表达及纯化。[方法]采用重叠PCR合成sbcB基因,通过酶切将其克隆至表达载体pET-30a上并转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,并对表达条件进行优化,获得限制性外切酶Ⅰ(EXO1)的大量表达。亲和层析纯化重组蛋白后对酶的活性进行研究。[结果]亲和纯化后获得大量表达蛋白EXO1,大小与预测的54.5 KD相符;以S1核酸外切酶为对照进行的功能验证证实:sbcB基因表达产物EXO1能够消化单链,但不会消化双链,纯化的EXO1具有很好的酶活性。[结论]依据本文方案制备的限制性外切酶Ⅰ(EXO1)产量高、纯度高,适用于实验室测序前PCR产物的处理。     

轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因转化苎麻的研究

利用套叠PCR技术对轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因进行了定点突变,将改造后的基因插入pBI121构建植物表达载体。在设计PCR引物时,引入植物表达载体pBI121具有的克隆位点BamH I和Sac I,利用BamH I和Sac I切除pBI121上的GUS基因并使载体质粒线性化,用同样的2种酶消化pTVP4克隆载体获得VP4基因片段,使之形成与线性化pBI121质粒相同的粘性末端。在T4DNA连接酶的作用下,将线性化pBI121质粒和酶切后的VP4基因片段连接成新的重组质粒pBI121/VP4,通过直接转化法转化到根癌农杆菌(Agrobacteriumefaciens)EHA105菌株中,获得农杆菌工程菌株。采用叶盘转化法转化苎麻(Boehmeria.nivea L.Guad)栽培品种圆叶青,以卡那霉素抗性作为转化植株的筛选标记获得抗性植株。经PCR、PCR Southernblot分析表明,初步获得了轮状病毒外壳蛋白VP4的转基因苎麻植株。     

鹅细小病毒四平分离株VP3基因的克隆与序列分析

根据已发表的鹅细小病毒(GPV)核苷酸序列,设计并合成了1对引物,对吉林农业大学预防兽医学研究室分离鉴定的GPV四平株(SP)主要保护性抗原蛋白VP3基因进行扩增。所得到的PCR产物片段大小约1.6 kb,与预期片段大小相符。将该片段纯化后与T载体连接,转化到感受态大肠杆菌JM-109中进行克隆。对所提质粒进行快速鉴定、PCR鉴定以及限制性内切酶NheⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒,对重组质粒测序并进行核苷酸序列分析。结果表明:GPV四平株VP3基因长1 605 nt,包含了完整编码GPV VP3蛋白阅读框,且与国内GPV分离株B,GD,HG5/82相应核苷酸序列和氨基酸序列的同源性较高,分别为96.2%,96.3%,96.4%和97.4%,98.7%,98.9%。据此认为,GPV四平株VP3基因可以作为构建具有普遍应用价值的基因工程疫苗的候选基因。     

猪Sarlb基因真核表达载体构建及鉴定

根据已发表的猪Sarlb基因序列设计合成1对带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,用RT-PCR方法从猪肝脏组织总RNA中扩增出Sarlb基因cDNA序列,纯化后,经BamHⅠ／XhoⅠ双酶切,克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）,获得pcDNA3,1（＋）一Sarlb重组载体。通过茵液PCR、双酶切及DNA直接测序分析,证实重组表达载体pcDNA3,1（＋）-Sarlb构建成功。     

猪轮状病毒VP4蛋白基因在大肠杆菌中的表达

[目的]研究猪的轮状病毒VP4蛋白基因在BL21大肠杆菌中的表达。[方法]以猪肺脏组织中分离的总RNA为模板,采用反转录聚合酶链式反应（1it—PCR）技术扩增VP4蛋白的部分基因,将PCR产物克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒PGEX-4T-1-VP4并对重组质粒进行酶切和测序鉴定。将重组载体PGEx4T-1-VP4转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达和SDS—PAGE分析,并对重组大肠杆菌进行可溶性分析。[结果]对猪肺脏组织中分离的总RNA进行RT—PCR扩增,获得875bp的VP4部分基因,重组质粒PGEX-4T-1-VP4经BamHI和Xho Ⅰ双酶切和测序鉴定后,插入的猪轮状病毒VP4的eDNA编码区序列与已公布的猪GenBank核酸序列比对结果为99．5％;将重组质粒pGEX-4T-1-VP4-一转化至大肠杆菌B121（DE3）中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约58kDa融合蛋白带。[结论]该研究为进一步研究轮状病毒的疫苗研制奠定了基础。