猪场环境测定及对敏感抗生素的筛选

猪舍环境不卫生是诱发疫病的重要因素之一,目前环境因素不被养殖户所重视,导致猪群疫病暴发,从而给养殖户造成经济损失。通过对猪场空气中以及饮用水中的细菌数进行检测,与国家规定的标准进行比较,对比是否符合环境养殖标准,通过药敏试验检测空气中常在的细菌对何种抗生素敏感,为养殖户合理用药提供理论依据。     

鹅细小病毒延边分离株VP3基因的克隆与序列分析

试验对鹅细小病毒延边分离株(YB株)VP3基因的克隆与序列进行了研究,并与GenBank上公布的国内外毒株VP3基因的核苷酸序列进行了同源性比较和系统进化树分析,为进一步研究鹅细小病毒的分子生物学特性和基因工程疫苗奠定了基础.     

犬新孢子虫NC-GFP株在4种细胞中培养的比较

为筛选出犬新孢子虫的最佳培养细胞,本试验对利用非洲绿猴肾细胞(Vero)、人胚肾细胞(HEK-293)、人宫颈癌细胞(HeLa)和小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)培养犬新孢子虫NC-GFP株进行了比较研究,连续培养犬新孢子虫15d,观察Vero细胞、HEK-293细胞、HeLa细胞及SP2/0细胞的形态变化并计数犬新孢子虫的数量,绘制虫体在细胞中生长曲线。结果表明,Vero细胞、HEK-293细胞、HeLa细胞及SP2/0细胞均可培养犬新孢子虫,尤其在HEK-293细胞和Vero细胞中虫体生长较快,分别在接种虫体的第5,6天虫体数量达到最大值;而犬新孢子虫在SP2/0细胞和HeLa细胞中生长缓慢,分别在第7,8天数量达到最大值,数量处于较低水平。综合比较,HEK-293细胞可以短期较快的培养犬新孢子虫,可作为一种新的细胞系培养犬新孢子虫。本试验为体外细胞培养犬新孢子虫提供了科学依据。     

小鹅瘟套式PCR诊断方法的建立及初步应用

本试验根据GenBank发表的小鹅瘟病毒B株基因序列,设计了两对VP3基因的特异性引物,进行PCR扩增,建立了小鹅瘟病毒套式PCR诊断方法,该方法能特异性地扩增出406 bp的小鹅瘟病毒VP3基因片段而对其他病毒基因组DNA均没有扩增出条带。本方法对病料中小鹅瘟病毒基因组DNA的最小检测量为0.02175 fg/μL。通过对延边地区疑似小鹅瘟的80只病死雏鹅进行了检测,阳性检出率为95%。结果表明,本试验建立的小鹅瘟病毒套式PCR诊断方法具有极高的敏感性和特异性且检出率极高,可作为一种有效的临床诊断方法。     

鹅细小病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank发表的鹅细小病毒(GPV)NS1基因序列设计合成了1对引物,以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测GPV核酸的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。检测结果表明,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数达到0.998;对初始模板的检出下限为30个拷贝/μL,比常规PCR方法高100倍;与鸭瘟病毒、犬细小病毒、新城疫病毒和鹅副粘病毒均不发生交叉反应;组内与组间的变异系数均小于2%。用建立的Real-time PCR检测13例GPV感染阳性病例,GPV阳性检出率为100%。表明建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于GPV的病原检测及定量分析。     

两种弓形虫疫苗对猪的免疫效果观察

[目的]研究2种弓形虫疫苗对猪的免疫效果。[方法]利用韩国国立兽医科学检疫院提供的2种弓形虫疫苗对试验猪群进行2次免疫。采用间接免疫荧光技术（IFAT）对一免、二免后猪群的抗体效价进行检测,评定疫苗对动物的免疫效果。[结果]首免后第2周,第1组疫苗的抗体效价达到1∶（119±24.18）,第2组疫苗的抗体效价达到1∶（96±39.19）;二免后第2周,第1组抗体效价平均值达到1∶（635±153.94）,第2组抗体效价达到1∶（547±165.84）,2组疫苗免疫效果差异不显著。[结论]试验用的2种弓形虫疫苗均对猪群起到一定的免疫效果。     

鹅细小病毒延边株VP3基因真核表达质粒构建

用碱裂解法对鹅细小病毒延边分离株进行GPV基因组DNA提取.根据已发表的鹅细小病毒VP3基因序列,设计1对含有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点的引物,以GPV基因组DNA为模板,应用PCR扩增出VP3基因片段,将VP3基因与克隆载体pMD 18-T连接,转化到感受态大肠杆菌BL21中进行克隆.用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切该片段并回收该片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pVAXI真核表达载体中,获得重组质粒pVAXI-VP3,经PCR鉴定,限制性内切酶双酶切分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性.     

鹅细小病毒单抗双夹心ELISA检测方法的建立

为建立鹅细小病毒(GPV)检测方法,本研究以兔抗GPV IgG为捕获抗体,抗GPV单克隆抗体为检测抗体,通过方阵试验确定了兔抗GPV IgG最适包被浓度为16 mg/L,抗GPV单克隆抗体最佳工作浓度为10.8 mg/L,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶4 000,建立了检测GPV单抗双夹心ELISA方法,对GPV检测灵敏度达0.312 mg/L.用该法对延边某养鹅场疑似发生小鹅瘟病的252只病死鹅进行检测,结果阳性率为75.79%,与病毒中和试验方法的检测结果符合率迭91.11%.本研究建立的单抗双夹心ELISA方法为GPV的检测和区城流行病学调查提供了一种简便快速的血清学诊断方法.     

新孢子虫核糖体磷蛋白基因真核表达载体的构建及瞬时表达

采用PCR技术扩增出新孢子虫核糖体磷蛋白(NcP0)全长基因片段,并将其克隆入真核表达载体pVAX1中,构建pVAX1-NcP0表达载体。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染Vero细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测和IFA检测目的基因的转录与表达情况。结果表明克隆的P0蛋白基因序列全长为1 379 bp;RT-PCR结果显示目的基因已被成功转录;IFA检测证明目的基因被成功表达。本试验成功构建了NcP0的真核表达载体,转染Vero细胞,获得了NcP0的瞬时表达。