东北黑熊养殖群体6个微卫星基因座遗传多态性研究

利用微卫星标记研究东北黑熊养殖群体的遗传多态性,及时掌握养殖群体的相关遗传信息,为今后黑熊的人工繁殖及育种、保种工作奠定基础。本研究选取了黑熊的6个微卫星基因座(MSUT2、MSUT4、UT3、UT35、UT36、UT38)对115头东北黑熊进行了遗传检测,利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行DNA分型以及ABI 3730遗传分析仪进行基因大小的判读,计算了6个微卫星位点的等位基因频率、多态信息含量(PIC)、杂合度等值。结果表明:东北黑熊养殖群体的6个微卫星座位共检测到51个等位基因,平均为8.5个;6个微卫星基因座的平均多态信息含量为0.641 9,其中5个微卫星基因座的PIC>0.5,6个微卫星基因座的平均观察杂合度、平均期望杂合度分别为0.529 9、0.641 7。数据证明,6个微卫星标记均具有高度多态性,可用于东北黑熊的遗传多样性分析。     

鹅细小病毒单抗双夹心ELISA检测方法的建立

为建立鹅细小病毒(GPV)检测方法,本研究以兔抗GPV IgG为捕获抗体,抗GPV单克隆抗体为检测抗体,通过方阵试验确定了兔抗GPV IgG最适包被浓度为16 mg/L,抗GPV单克隆抗体最佳工作浓度为10.8 mg/L,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶4 000,建立了检测GPV单抗双夹心ELISA方法,对GPV检测灵敏度达0.312 mg/L.用该法对延边某养鹅场疑似发生小鹅瘟病的252只病死鹅进行检测,结果阳性率为75.79%,与病毒中和试验方法的检测结果符合率迭91.11%.本研究建立的单抗双夹心ELISA方法为GPV的检测和区城流行病学调查提供了一种简便快速的血清学诊断方法.     

东北黑熊不同基因组DNA模板来源的比较研究

文章主要探讨使用黑熊毛发作为试验材料替代其他生物样品进行遗传多样性研究的可行性,筛选满足试验需求的最佳使用量.以延边白头山制药有限公司养熊场的4头成年东北黑熊为试验材料,分别5次拾取2头黑熊铁笼内散落的带有毛囊的50、100根毛发,对麻醉的2头黑熊抽取全血3 mL以及皮下结缔组织1 g,并分别采用不同方法提取基因组DNA.以微卫星位点ABB12和UT35为引物,设置20、50、100 ng·μL-13种模板浓度进行PCR扩增.结果显示,采用50 ng·μL-1的模板浓度均可获得较好的PCR产物,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增基因具有较好的分辨效果.毛发DNA、血液DNA和组织DNA的PCR产物数量和质量并无明显差异.毛发数量与所提取的DNA浓度有一定关系.利用15个毛发DNA的PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,均可观察到清晰的条带.研究结果进一步证明毛发DNA可作为东北黑熊遗传多样性研究的试验材料.     

Vero细胞体外培养条件的优化

为了优化一种适合Vero细胞体外快速生长,且生长状态良好的培养条件,笔者对比了2种不同培养条件下的细胞生物学观察结果,Vero细胞经台盼兰活体染色,改进培养条件后细胞活体率为97.8%,比原始培养条件下活体率明显增高,且该方法具有简便、易行、成本低等优点,值得进一步推广应用。     

新孢子虫核糖体磷蛋白基因真核表达载体的构建及瞬时表达

采用PCR技术扩增出新孢子虫核糖体磷蛋白(NcP0)全长基因片段,并将其克隆入真核表达载体pVAX1中,构建pVAX1-NcP0表达载体。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染Vero细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测和IFA检测目的基因的转录与表达情况。结果表明克隆的P0蛋白基因序列全长为1 379 bp;RT-PCR结果显示目的基因已被成功转录;IFA检测证明目的基因被成功表达。本试验成功构建了NcP0的真核表达载体,转染Vero细胞,获得了NcP0的瞬时表达。     

新孢子虫P0基因DNA疫苗免疫沙鼠诱导的免疫应答

为了筛选得到免疫效果较理想的核酸疫苗,采用pVAXⅠ为真核表达载体,新孢子虫P0基因为目的基因,构建了重组质粒pVAXⅠ-NcP0。用重组质粒免疫成年沙鼠60只,剂量为100μg/只,每隔14 d免疫1次,共免3次,首免后每周尾静脉采血1次,三免后第2周,每组处死7只沙鼠,无菌取脾。采用间接荧光抗体试验检测沙鼠血清抗体效价,流式细胞仪检测脾T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+数量。结果:Cp-M佐剂组、pVAXⅠ-NcP0组的抗体效价均高于pVAXⅠ空载体组和对照组,其中Cp-M组效价最高;脾T淋巴细胞亚群数量测定发现,疫苗Cp-M佐剂组、pVAXⅠ-NcP0组的CD4+细胞含量均高于pVAXⅠ空载体组和对照组,Cp-M组、pVAXⅠ-NcP0组与pVAXⅠ空载体组和对照组均差异极显著(P<0.01),Cp-M组、pVAXⅠ-NcP0组的CD8+细胞含量均高于pVAXⅠ空载体组和对照组,Cp-M佐剂组与pVAXⅠ空载体组和对照组差异显著(P<0.05)。表明DNA疫苗pVAXⅠ-NcP0既能较好地刺激细胞免疫又能产生一定的体液免疫反应,可作为候选核酸疫苗进行下一步本体动物免疫试验研究。     

应用间接ELISA方法检测牛新孢子虫抗体的研究

新孢子虫病(Neosporosis)是由犬新孢子虫(Neospora caninum)或类新孢子虫(Neosporalike)寄生于宿主动物所引起的多种家畜共患的一种原虫病[1].它可引起孕畜流产或死胎以及新生儿的运动障碍和神经系统疾病[2].目前,国外已研制出ELISA诊断试剂盒,但价格昂贵,不适合临床推广应用.而国内虽然建立了多种血清学诊断方法,但所用抗原均为重组蛋白,其敏感性、特异性将会受到不同程度的影响.因此,针对上述问题,试验对新孢子虫虫体抗原进行了分析,并应用新孢子虫虫特异性抗原建立了特异、敏感、稳定的血清学诊断方法,旨在为今后新孢子虫病的诊断和预防研究奠定基础.     

新孢子虫速殖子灭活苗对沙鼠的免疫保护性试验

为验证2种新孢子虫速殖子灭活苗的免疫保护作用,以沙鼠为试验动物,用2种不同佐剂疫苗对沙鼠进行免疫,21 d后用新孢子虫速殖子(1×106/只)进行皮下攻毒,观察死亡情况.试验结果表明,第Ⅰ种疫苗保护率为85%(17/20),第Ⅱ种疫苗保护率为80%(16/20),并在死亡沙鼠组织DNA均扩增出新孢子虫特异的基因片段.