HSPB1基因对脂多糖诱导的鸡巨噬细胞炎症反应的调控机制

为了探究热休克因子结合蛋白1(heat shock factor binding protein 1,HSPB1)基因对脂多糖(LPS)诱导的鸡巨噬细胞(HD11细胞)炎症反应的调控机制，试验以不同浓度的LPS刺激HD11细胞不同时间，构建HD11细胞炎症模型，利用HSPB1基因过表达质粒pcDNA3.1-HSPB1瞬时转染HD11细胞后再用最佳浓度的LPS进行刺激，并以仅转染pcDNA3.1和pcDNA3.1-HSPB1的HD11细胞为对照，采用实时荧光定量PCR方法检测转染HSPB1基因过表达质粒pcDNA3.1-HSPB1后对白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)和α干扰素(IFN-α)基因表达的影响。结果表明：在LPS浓度为1μg/mL、刺激时间为9 h时炎症因子IL-1β基因相对表达量极显著升高(P<0.01),成功构建出HD11细胞炎症模型；与转染pcDNA3.1质粒相比，转染HSPB1基因过表达质粒pcDNA3.1-HSPB1后能极显著下调IL-6、IL-1β和IFN-α基因的相对表达量(P<0.01);受LPS刺激且仅转染pcDNA3.1...     

小反刍兽疫病毒疫苗毒株N75-1感染细胞源外泌体对山羊SLAM表达的影响

淋巴细胞信号活化分子（SLAM）是小反刍兽疫病毒（PPRV）在淋巴细胞的主要受体。本研究旨在探索PPRV感染细胞源外泌体对山羊SLAM表达的影响。通过荧光定量PCR法、流式细胞术和Western blot技术检测PPRV疫苗毒株N75-1感染山羊外周血单核细胞（PBMCs）源外泌体（Exo-PPRV）共育对接纳细胞（正常山羊PBMCs）中SLAM表达水平和细胞因子分泌水平的影响。结果表明,与正常细胞分泌外泌体（Exo-Mock）共育组相比,Exo-PPRV共培养组细胞SLAM mRNA和细胞表面表达水平均显著上调（P<0.05）,TNF-α、IL-10和IFN-γ表达水平升高,而IFN-α水平降低（P<0.05）。进一步研究表明,Exo-PPRV中荷载高水平的PPRV H蛋白且可以将其传递至接纳细胞中,同时pcDNA3.1-H转染组中SLAM表达水平较pcDNA3.1对照转染组和未转染组明显升高。以上结果表明,PPRV感染PBMCs源外泌体对接纳细胞中SLAM表达水平具有显著正调控作用,外泌体中载荷高水平PPRV H蛋白是其调控接纳细胞SLAM表达的关键分子之一。     

猪Neuronatin基因在pTr2细胞内葡萄糖转运中的功能研究

本研究旨在探索印记基因NNAT 2个转录本NNAT-α、NNAT-β在猪胎盘滋养层细胞(pTr2)中的功能.实验通过NCBI数据库公布的猪NNAT-α、NNAT-β的CDs序列信息设计引物,并构建了pcDNA3.1-NNAT-α和pcDNA3.1-NNAT-β真核表达载体,经过双酶切、连接转化、测序鉴定后,将表达载体转...     

犬瘟热病毒V蛋白的表达、鉴定及亚细胞定位

为研究犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV） V蛋白的功能,将CDV V基因片段与pGEX-6P-1载体连接,构建pGEX-6P-1-CDV-V重组表达质粒,通过原核表达系统表达了V蛋白,并将纯化的V蛋白免疫BALB/c小鼠,制备阳性血清。同时,将CDV V基因片段与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNA3.1-CDV-V重组表达质粒,经转染Vero细胞后,用激光共聚焦技术确定V蛋白在真核细胞中的分布及亚细胞定位。结果显示,成功表达了V蛋白,并制备了阳性血清。重组质粒pcDNA3.1-CDV-V在外源真核细胞Vero中获得了表达,表达蛋白主要聚集于细胞质。本试验结果为进行CDV V蛋白的功能研究奠定了基础。     

山羊RORα基因的克隆、表达载体构建及功能分析

旨在克隆山羊维甲酸相关孤儿受体α(RORα)基因并构建其真核表达载体,然后利用生物信息学工具系统分析RORα的生物学特性,最后对其在山羊生物钟系统中的作用机制进行初步探究。本研究以1只健康的12月龄雄性西农萨能奶山羊为试验动物,提取其肝组织总RNA,经逆转录PCR反转录为cDNA后,利用常规PCR扩增山羊RORα基因的编码区(coding sequence,CDS)片段,使用同源重组法将其与pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体相连接; 重组载体经PCR、酶切和测序鉴定后,将阳性质粒命名为pcDNA3.1-3HA-gRORα; 将pcDNA3.1-Puro-N-3HA和pcDNA3.1-3HA-gRORα质粒分别转染至HEK293T细胞后,通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)和蛋白质免疫印迹(western blotting,WB)技术检测山羊RORα的表达; 同时利用ExPASy、ProtScale等软件对山羊RORα基因进行系统的生物信息学分析。另外,使用同源重组法分别构建含有山羊生物钟基因BMAL1和NR1D1启动子片段的pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc及pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc的荧光素酶报告质粒,并通过双荧光素酶报告试验探究山羊RORα蛋白调控BMAL1和NR1D1基因启动子转录活性的作用机制。PCR、酶切和测序鉴定结果表明,pcDNA3.1-3HA-gRORα重组质粒构建成功; qPCR和WB结果显示,pcDNA3.1-3HA-gRORα转染组RORα基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平均显著高于pcDNA3.1-Puro-N-3HA转染组(P < 0.01)。生物信息学分析结果显示,山羊RORα基因CDS区序列与绵羊、牛和猪的相似性较高,分别为97.5%、97.1%和95.2%。山羊的RORα蛋白是一种亲水性蛋白。二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,有信号肽的概率较小,无跨膜区; 三级结构与小鼠和人的RORα蛋白差异性极小,三者具有高度相似性。此外,PCR、酶切和测序结果表明,pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc和pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc重组质粒构建成功。双荧光素酶报告试验结果表明,山羊RORα蛋白可以显著上调山羊BMAL1和NR1D1基因启动子的转录活性。本研究成功构建了山羊RORα基因的真核表达载体,并证明了RORα蛋白可以正向调控山羊BMAL1和NR1D1基因的启动子活性,这为进一步探究山羊核受体RORα的功能及山羊生物钟的转录调控机制提供了前期基础。     

靶向FMDV受体猪源整联蛋白αv亚基基因抑制FMDV复制的最佳siRNA筛选

筛选靶向FMDV受体猪源整联蛋白αv亚基基因抑制FMDV复制的最佳siRNA.根据猪源αv mRNA序列,设计并合成siRNA,Lipofectamine 2000转染siRNA于PK-15细胞,利用qRT-PCR检测RNAi组(iαv-480、iαv-1719和iαv-2077)、空白组(Mock)和阴性对照组(Control)中αvmRNA表达情况；在转染siRNA12 h后通过接种100 TCID50,收集病毒液,测定TCID50,确定其抗病性变化.结果显示,瞬间转染PK-15后,与阴性对照组和空白组相比,3个RNAi组均不同程度抑制αv亚基基因表达,在24 h iαv-480组在mRNA水平抑制90.1％,作用最明显.TCID50测定表明iαv-480组有较低的病毒滴度,说明其抗病性增加.针对猪源整联蛋白αv亚基基因的最佳siRNA的筛选成功,为深入研究干扰FMDV受体抗FMDV转基因路线奠定了基础.     

实时荧光定量PCR筛选牛源整联蛋白αv基因的siRNA片段

设计并合成三条针对牛口蹄疫病毒(FMDV)整联蛋白受体αv亚基基因的特异性干扰小RNA(SiRNA)片段,将其转染至本身表达整联蛋白受体αv亚基基因的MDBK细胞.分别在转染后36 h和48 h收集细胞,提取细胞总RNA并反转录为cDNA.应用SYBR GreenI实时荧光定量RT-PCR的方法检测3个siRNA片段的...     

基于表面等离子体共振(SPR)技术实时分析RGD基序与整联蛋白的相互作用

旨在研究口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）结构蛋白VP1上的RGD（Arg-Gly-Asp）基序与宿主细胞表面受体整联蛋白的结合特异性,作者应用基于表面等离子共振技术（SPR）的Biacore 3000系统实时研究RGD基序分别与猪源整联蛋白α_vβ₆胞外区结构域、α_v亚基胞外区结构域和β₆亚基胞外区结构域的亲和力。首先通过结合试验筛选与RGD基序有结合的整联蛋白结构域,再对有结合的整联蛋白与RGD基序开展动力学分析。结果显示,合成的RGD基序与猪源整联蛋白α_vβ₆胞外区结构域有结合,结合动力学常数K_a、K_d、K_D分别为42.3 M^-1s^-1、3.1×10^-4s^-1和7.33×10^-6M;与整联蛋白α_v亚基胞外区结构域之间亦有结合,结合动力学常数K_a、K_d、K_D分别为21.8 M^-1s^-1、2.13×10^-4s^-1和9.79×10^-5M;与β₆亚基胞外区结构域几乎没有结合。综上表明,RGD与整联蛋白α_vβ₆胞外区结构域的结合比与整联蛋白α_v亚基胞外区结构域之间的结合快且亲和力强。本研究将为进一步探讨FMDV与宿主细胞表面受体的相互作用提供参考。     

PRRSV清道夫受体CD163基因的真核表达和功能鉴定

从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中提取总RNA为模板,采用RT-PCR法获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的受体CD163全基因,将该基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1/V5-HIS A上,构建出真核重组质粒pcDNA3.1-CD163,经酶切和DNA测序证明获得了CD163基因,其序列与GenBank报道序列比较,核苷酸同源性为99.37%。将测序正确的CD163基因在脂质体LipofectamineTM2000介导下转染PK-15细胞,通过间接免疫荧光(IFA)检测到了CD163在PK-15中的表达。将转染的细胞感染PRRSV后,经IFA检测转染CD163的细胞能够被PRRSV感染。     

口蹄疫病毒受体整联蛋白在绵羊不同发育阶段组织中mRNA转录水平的分析

口蹄疫病毒野毒株利用整联蛋白（integrin）αvβ1、αvβ3、αvβ6和αvβ8作为受体侵入细胞。本研究采用实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）技术,定量检测绵羊胎儿（45、75和110 d的绵羊胎儿）、新生羔羊和成年绵羊组织中整联蛋白亚单位αv、β3、β6和β8转录水平。比较分析发现,在蹄冠上皮组织中,成年绵羊和新生羔羊的β6 mRNA水平低于75和110 d胎儿的;在心组织中,成年绵羊、新生羔羊和110 d胎儿的β6 mRNA高于45和75 d胎儿的;在肌肉组织中,胎儿和新生羔羊的β6以及β8 mRNA水平高于成年绵羊的;在舌上皮组织中,成年绵羊的β3 mRNA水平低于其他发育时期的。在软腭组织、扁桃体中整联蛋白mRNA水平在胎儿、新生儿和成年绵羊之间变化不大。本研究首次获得相关整联蛋白mRNA在绵羊不同发育阶段组织中分布的定量数据,为了解整联蛋白在口蹄疫病毒感染组织嗜性中的作用机制提供新的科学依据。     

猪生长激素促分泌素受体基因真核表达载体的构建及鉴定简

本试验旨在构建猪生长激素促分泌素受体（pGHS-R）真核表达系统,并瞬时转染人源胚胎肾细胞（HEK293T）观察其表达情况。以猪基因组为模板,通过剪接重叠延伸聚合酶链式反应（SOE-PCR）克隆出pGHS-R的编码区序列,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)/pGHS-R,酶切鉴定并测序,加myc标签,瞬时转染HEK293T细胞,用Western blotting鉴定该重组质粒是否能在真核细胞中表达相应的目的蛋白。结果显示,本试验成功扩增出pGHS-R编码序列,酶切和测序结果表明pcDNA3.1(+)-myc/pGHS-R构建正确,Western blotting方法证实转染的该质粒能在HEK293T细胞中正确表达目的蛋白。结果表明,本试验成功构建了pGHS-R真核表达载体,并正确表达蛋白,为进一步研究GHS-R的功能奠定了基础。     

山羊生物钟基因CLOCK真核表达载体的构建和生物信息学分析

试验旨在构建山羊昼夜运动输出周期蛋白(circadian locomotor output cycles kaput,CLOCK)基因真核表达载体,系统分析山羊CLOCK蛋白的生物学特性。从山羊卵巢组织中提取总RNA,反转录成cDNA后经PCR扩增山羊CLOCK基因CDS区序列,并以同源重组的方式将其连接至pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体;经PCR、酶切和测序鉴定后,将阳性质粒命名为pcDNA3.1-3HA-gCLOCK;将pcDNA3.1-Puro-N-3HA和pcDNA3.1-3HA-gCLOCK质粒分别转染至HEK293T细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测山羊CLOCK基因的表达效果,并对山羊CLOCK基因进行系统的生物信息学分析。结果显示,山羊CLOCK基因CDS区片段长2 538 bp,将其与线性化的pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体重组连接并通过酶切和测序鉴定后,成功构建了pcDNA3.1-3HA-gCLOCK真核表达载体;实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,pcDNA3.1-3HA-gCLOCK转染组CLOCK基因在mRNA和蛋白水平的表达量均极显著高于pcDNA3.1-Puro-N-3HA对照组(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,山羊CLOCK基因CDS区序列与绵羊、牛和马的相似性分别为99.4%、98.7%和95.6%。山羊CLOCK蛋白是一种不稳定蛋白,具有一定的亲水性,无跨膜区和信号肽。二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成;三级结构与小鼠和人的CLOCK蛋白相比具有极高的相似性。本研究成功构建了山羊生物钟基因CLOCK真核表达载体,并进行了生物信息学分析,为进一步研究山羊CLOCK基因的生物学功能及山羊生物钟的转录调控机制提供了材料。     

猪β_2肾上腺素能受体基因真核表达载体及突变体的构建及表达

试验旨在构建猪β_2肾上腺素能受体(β_2adrenergic receptor,β_2AR)基因及其突变体真核表达载体,并鉴定其在HEK293T细胞中的表达。通过猪基因组DNA克隆猪β_2AR基因,利用同源重组技术将其连接至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-β_2AR,加入c-myc标签后命名为myc-pcDNA3.1(+)-β_2AR。以真核表达载体为模板构建突变体myc-pcDNA3.1(+)-β_2AR-D130N、myc-pcDNA3.1(+)-β_2AR-C285S和mycpcDNA3.1(+)-β_2AR-D130N/C285S,并将构建的真核表达载体和突变体转染HEK293T细胞,利用Western blotting技术验证其表达。结果显示,猪β_2AR基因已正确重组入pcDNA3.1(+)载体中;经测序鉴定,猪β_2AR的第130位天冬氨酸成功突变为天冬酰胺,第285位半胱氨酸成功突变为丝氨酸。Western blotting检测结果证明所构建的表达载体均可在HEK293T细胞中表达。本研究成功构建了猪β_2AR野生型的真核表达载体及2个单点突变和1个双点突变的突变体,并验证其在HEK293T细胞中正常表达,为进一步研究猪β_2AR蛋白表达及其药理学活性奠定基础。     

鸡Mx-EGFP融合表达蛋白的细胞亚定位及其抗病毒活性研究

为探索鸡Mx基因在细胞中表达的位置,以及Mx-EGFP融合表达时的抗病活性。构建了真核表达载体pcDNA3.0/EGFP-Mx,转染NIH-3T3细胞,通过报告基因EGFP的表达来定位Mx基因在细胞中表达的位置;通过抗VSV病毒试验来研究Mx-EGFP融合蛋白的抗病毒活性。结果显示,融合蛋白大部分在细胞质中表达,而细胞核中也有一部分表达;转染有质粒pcDNA3.0/EGFP-Mx的NIH-3T3细胞感染VSV病毒48h内,细胞没有发生病变;而只转染pcDNA3.0空载体的阴性对照组中,NIH-3T3细胞48h内已经发生病变。研究结果表明,Mx-EGFP融合蛋白主要分布在细胞质中,具有抗VSV病毒活性,能够延缓病毒感染病变时间。     

乙型脑炎病毒NS1和NS1-2A蛋白的真核表达及其差异性研究

为深入研究乙型脑炎病毒（JEV）NS1和NS1-2A蛋白的表达和免疫效果差异,本试验构建并扩增C-端含Flag标签的NS1和NS1-2A基因,利用T4 DNA连接酶分别连接到质粒pcDNA3.1（+）上,构建重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag。将这两种真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,利用RT-PCR、IFA和Western blotting检测NS1和NS1-2A蛋白在体外的表达情况,用pcDNA3.1-NS1-Flag、pcDNA3.1-NS1-2A-Flag和pcDNA3.1（+）免疫BALB/c小鼠,检测这两种蛋白在体内的表达差异。结果显示,试验成功构建了NS1和NS1-2A基因的真核表达载体pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag,IFA和Western blotting鉴定NS1和NS1-2A蛋白成功表达,重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠后可诱发机体产生特异性体液免疫,pcDNA3.1-NS1-2A-Flag联合免疫组小鼠血清抗体效价和INF-γ细胞因子分泌水平比pcDNA3.1-NS1-Flag免疫组高,且与pcDNA3.1（+）空载体免疫组差异极显著（P<0.01）;pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫组小鼠体内的INF-γ分泌量会增多,免疫第4周达到最高后逐渐降低。pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠能够刺激JEV特异性抗体的分泌和增强机体的细胞免疫功能,且NS1-2A联合基因的免疫效果优于NS1单一基因,为进一步研究JEV的非结构蛋白功能、研发NS1和NS1-2A基因疫苗奠定基础。     

猪IL-2真核表达质粒构建及对PRRSV-ORF5基因疫苗免疫佐剂作用的研究

本研究应用真核表达载体pcDNA3.1（＋）和猪白细胞介素2（IL-2）基因成功构建了IL-2的真核表达质粒（pcDNA-IL-2）,探讨了pcDNA-IL-2作为分子免疫佐剂对猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）ORF5基因疫苗（pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5）免疫猪的增强作用。经间接ELISA法、MTT比色法及流式细胞仪分别对pcDNA-IL-2与pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5共同免疫猪、pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5单独免疫猪、pcDNA3.1（＋）空载体和灭菌水免疫对照猪的血清抗PRRSV抗体IgG、外周血T淋巴细胞的增殖活性、CD4^＋和CD8^＋细胞比例进行检测,结果表明pcDNA-IL-2与pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5共同免疫猪的IgG含量、外周血T淋巴细胞的增殖活性、CD4^＋和CD8^＋细胞比例与pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5单独免疫猪相比有显著差异（P〈0.05）。说明pcDNA-IL-2能显著增强pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5基因疫苗免疫猪的体液和细胞免疫应答,可作为PRRSV基因疫苗的良好佐剂。     

基于表面等离子体共振(SPR)技术实时分析RGD基序与整联蛋白的相互作用

旨在研究口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)结构蛋白VP1上的RGD(Arg-Gly-Asp)基序与宿主细胞表面受体整联蛋白的结合特异性,作者应用基于表面等离子共振技术(SPR)的Biacore 3000系统实时研究RGD基序分别与猪源整联蛋白α_vβ_6胞外区结构域、α_v亚基胞外区结构域和β_6亚基胞外区结构域的亲和力。首先通过结合试验筛选与RGD基序有结合的整联蛋白结构域,再对有结合的整联蛋白与RGD基序开展动力学分析。结果显示,合成的RGD基序与猪源整联蛋白α_vβ_6胞外区结构域有结合,结合动力学常数K_a、K_d、K_D分别为42.3 M~(-1)s~(-1)、3.1×10~(-4)s~(-1)和7.33×10~(-6)M;与整联蛋白α_v亚基胞外区结构域之间亦有结合,结合动力学常数K_a、K_d、K_D分别为21.8 M~(-1)s~(-1)、2.13×10~(-4)s~(-1)和9.79×10~(-5)M;与β_6亚基胞外区结构域几乎没有结合。综上表明,RGD与整联蛋白α_vβ_6胞外区结构域的结合比与整联蛋白α_v亚基胞外区结构域之间的结合快且亲和力强。本研究将为进一步探讨FMDV与宿主细胞表面受体的相互作用提供参考。     

生长抑素基因靶向siRNA表达载体的构建及对生长抑素基因表达的抑制作用

合成含靶向生长抑素（Somatostatin,SS）前体基因的siRNA转录模板的发夹结构,插入pSilencerTM2.1-U6载体构建重组质粒2.1-S。提取小鼠下丘脑组织总RNA,PCR扩增获得SS前体基因cDNA,构建真核表达载体pcDNA3.1-SS、pEGFP-SS。将2.1-S分别与pcDNA3.1-SS、pEGFP-SS共转染入细胞中瞬时表达,检测SS前体基因表达变化。结果显示,重组质粒在E.coli（DH5α）内扩增,酶切及测序鉴定证明siRNA转录模板完整,正确地插入到pSilencerTM2.1-U6质粒中,重组质粒pcDNA3.1-SS与pEGFP-SS经测序序列完全正确。转染细胞在mRNA水平及蛋白水平均检测到2.1-S对SS前体基因表达的抑制。这表明,SS基因靶向siRNA稳定表达载体能在哺乳动物细胞中表达,并对靶基因呈抑制作用。     

猪β2肾上腺素能受体基因真核表达载体及突变体的构建及表达

试验旨在构建猪β₂肾上腺素能受体（β₂ adrenergic receptor,β₂AR）基因及其突变体真核表达载体,并鉴定其在HEK293T细胞中的表达。通过猪基因组DNA克隆猪β₂AR基因,利用同源重组技术将其连接至真核表达载体pcDNA3.1（+）,构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-β₂AR,加入c-myc标签后命名为myc-pcDNA3.1（+）-β₂AR。以真核表达载体为模板构建突变体myc-pcDNA3.1（+）-β₂AR-D130N、myc-pcDNA3.1（+）-β₂AR-C285S和myc-pcDNA3.1（+）-β₂AR-D130N/C285S,并将构建的真核表达载体和突变体转染HEK293T细胞,利用Western blotting技术验证其表达。结果显示,猪β₂AR基因已正确重组入pcDNA3.1（+）载体中;经测序鉴定,猪β₂AR的第130位天冬氨酸成功突变为天冬酰胺,第285位半胱氨酸成功突变为丝氨酸。Western blotting检测结果证明所构建的表达载体均可在HEK293T细胞中表达。本研究成功构建了猪β₂AR野生型的真核表达载体及2个单点突变和1个双点突变的突变体,并验证其在HEK293T细胞中正常表达,为进一步研究猪β₂AR蛋白表达及其药理学活性奠定基础。     

蓝舌病毒NS4基因真核表达对IFN-β信号通路基因mRNA表达的影响

通过构建蓝舌病毒(BTV)NS4基因真核表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP,转染HEK-293T细胞,利用Western blot及荧光显微镜分析NS4蛋白的表达与亚细胞定位特征;pcDNA3.1-NS4-eGFP转染的HEK-293T细胞添加20 HAU/mL仙台病毒(SeV)刺激后,qRT-PCR法分析NS4基因表达对SeV诱导的上游识别基因RIG-Ⅰ、MDA5、VISA、TBK1、IKKε、IRF3、TRAF3、TRAF6、IRF9、干扰素基因(IFN-α、IFN-β)以及干扰素刺激基因ISG15和USP18的mRNA表达水平的影响。在HEK-293T细胞内转染pcDNA3.1-NS4-eGFP质粒24 h后,分别添加20 HAU/mL SeV刺激24,48 h,qRT-PCR结果表明,细胞内表达NS4-EGFP后,RIG-Ⅰ、MDA5、TRAF6、IRF9、ISG15及IFN-β基因mRNA表达极显著下降,随着SeV诱导时间的延长,VISA、TBK1、IKKε、USP18基因mRNA表达差异呈不显著趋势。本研究成功构建BTV NS4基因真核表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP,NS4-EGFP融合蛋白在HEK-293T细胞中主要分布于细胞核周围及细胞核内。BTV NS4基因在HEK-293T细胞内的表达显著下调SeV诱导的IFN信号通路相关基因RIG-Ⅰ、MDA5、TRAF6、IRF9、ISG15和IFN-β的表达,为进一步探究NS4基因在BTV拮抗宿主细胞免疫应答中的机制奠定基础。