猪食欲肽2受体突变体真核表达载体的构建及其对cAMP信号通路的影响

试验旨在构建猪食欲肽2受体（porcine orexin 2 receptor,pOX2R）突变体的真核表达载体,探究其野生型与突变体的基础药理学活性差异。以pcDNA3.1（+）-myc/pOX2R野生型质粒为模板,设计特异性引物单点突变构建4种突变体：pcDNA3.1（+）-myc/pOX2R-P10S、pcDNA3.1（+）-myc/pOX2R-P11T、pcDNA3.1（+）-myc/pOX2R-V308I和pcDNA3.1（+）-myc/pOX2R-T401I,将pcDNA3.1（+）-myc/pOX2R野生型和4种突变体分别瞬时转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告基因检测法测定pOX2R野生型及突变体的基础活性,并检测不同浓度激动剂作用下细胞内cAMP水平,随后用内源性激动剂食欲肽A （OXA）及食欲肽B （OXB）分别对野生型及突变体进行刺激。结果显示,4个突变体构建成功,pOX2R的第10、11、308和401位氨基酸分别突变为丝氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。将pOX2R的野生型及4个突变体瞬时转染HEK293T细胞后,野生型与突变体的基础活性值无显著差异（P>0.05）,表明这4个位点的氨基酸突变对其受体的基础表达信号无显著影响。与野生型受体相比,突变型受体对激动剂OXB的响应无显著差异（P>0.05）,而突变体P10S、P11T和T401I对激动剂OXA的响应EC₅₀显著降低（P<0.05）,其R_max无显著差异（P>0.05）。推测第10、11和401位点的氨基酸突变可能影响了激动剂OXA与受体的结合,降低了激动剂的激动效应。本研究结果为进一步体外研究pOX2R的功能奠定了基础。     

猪食欲肽2受体突变体真核表达载体的构建及其对cAMP信号通路的影响

试验旨在构建猪食欲肽2受体(porcine orexin 2receptor,pOX2R)突变体的真核表达载体,探究其野生型与突变体的基础药理学活性差异。以pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R野生型质粒为模板,设计特异性引物单点突变构建4种突变体:pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-P10S、pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-P11T、pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-V308I和pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-T401I,将pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R野生型和4种突变体分别瞬时转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告基因检测法测定pOX2R野生型及突变体的基础活性,并检测不同浓度激动剂作用下细胞内cAMP水平,随后用内源性激动剂食欲肽A(OXA)及食欲肽B(OXB)分别对野生型及突变体进行刺激。结果显示,4个突变体构建成功,pOX2R的第10、11、308和401位氨基酸分别突变为丝氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。将pOX2R的野生型及4个突变体瞬时转染HEK293T细胞后,野生型与突变体的基础活性值无显著差异(P0.05),表明这4个位点的氨基酸突变对其受体的基础表达信号无显著影响。与野生型受体相比,突变型受体对激动剂OXB的响应无显著差异(P0.05),而突变体P10S、P11T和T401I对激动剂OXA的响应EC50显著降低(P0.05),其Rmax无显著差异(P0.05)。推测第10、11和401位点的氨基酸突变可能影响了激动剂OXA与受体的结合,降低了激动剂的激动效应。本研究结果为进一步体外研究pOX2R的功能奠定了基础。     

猪β2肾上腺素能受体基因真核表达载体及突变体的构建及表达

试验旨在构建猪β₂肾上腺素能受体（β₂ adrenergic receptor,β₂AR）基因及其突变体真核表达载体,并鉴定其在HEK293T细胞中的表达。通过猪基因组DNA克隆猪β₂AR基因,利用同源重组技术将其连接至真核表达载体pcDNA3.1（+）,构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-β₂AR,加入c-myc标签后命名为myc-pcDNA3.1（+）-β₂AR。以真核表达载体为模板构建突变体myc-pcDNA3.1（+）-β₂AR-D130N、myc-pcDNA3.1（+）-β₂AR-C285S和myc-pcDNA3.1（+）-β₂AR-D130N/C285S,并将构建的真核表达载体和突变体转染HEK293T细胞,利用Western blotting技术验证其表达。结果显示,猪β₂AR基因已正确重组入pcDNA3.1（+）载体中;经测序鉴定,猪β₂AR的第130位天冬氨酸成功突变为天冬酰胺,第285位半胱氨酸成功突变为丝氨酸。Western blotting检测结果证明所构建的表达载体均可在HEK293T细胞中表达。本研究成功构建了猪β₂AR野生型的真核表达载体及2个单点突变和1个双点突变的突变体,并验证其在HEK293T细胞中正常表达,为进一步研究猪β₂AR蛋白表达及其药理学活性奠定基础。     

鸡黑素皮质素受体3真核表达载体及突变型的构建和表达

试验旨在构建鸡黑素皮质素受体3(c MC3R)基因的真核表达载体,并在人源胚胎肾细胞(HEK293T)观察目的基因的表达情况。从新鲜鸡血液提取全基因组DNA,并以其为模板,聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因编码区。凝胶纯化回收目的基因,用限制性内切酶Eco RⅠ和XbaⅠ目的基因和真核表达载体pc DNA3.1(+),并将双酶切后的目的基因定向插入表达载体中。经酶切和测序正确后加入c-myc标签。单点突变构建pc DNA3.1(+)-myc/MC3R突变型,用脂质体法将重组质粒pc DNA3.1(+)-myc/MC3R分别瞬时转染入HEK293T细胞中,流式细胞仪检测野生型和突变型的细胞表面表达和胞内总表达。结果表明,成功构建了鸡MC3R基因野生型和四个突变型(M54L、G104S、L151R和S183S)的真核表达载体,突变型与野生型在HEK293T细胞中的表面表达和胞内总表达没有显著性差异,研究结果为进一步研究c MC3R功能奠定基础。