小反刍兽疫病毒感染对山羊外周血单核细胞源外泌体分泌水平的影响

提取小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)疫苗毒N75-1株感染以及未感染对照山羊外周血单个核细胞(PBMCs)源外泌体,通过纳米颗粒示踪分析技术(NTA)测定提取外泌体粒径和分布范围,并通过Western blot技术和流式细胞术检测外泌体表面标志物CD63和CD81的表达水平;然后将PPRV感染PBMCs源外泌体与正常山羊PBMCs共培养,同时设定正常山羊PBMCs源外泌体共培养组以及PBMCs培养对照组,通过荧光定量PCR法和Western blot技术检测以上各组受体细胞中PPRV特异性受体淋巴信号活化分子(SLAM)表达水平变化。结果显示,PPRV感染及对照山羊PBMCs中外泌体粒径主要分布在100 nm,且感染组外泌体(Exo-PPRV)分泌水平较正常对照组(Exo-Mock)显著升高(P0.05);Exo-PPRV共培养组SLAM mRNA和蛋白质表达水平较Exo-Mock组显著上调(P0.05),Exo-Mock组与PBMCs培养对照组间SLAM mRNA和蛋白质表达水平差异不显著。结果表明,PPRV感染能够诱导山羊PBMCs中外泌体分泌水平升高且该外泌体对未感染PBMCs中PPRV受体SLAM的表达水平具有显著的正调控作用。     

Novel＿miR218对山羊外周血单核细胞中SLAM受体表达的影响

为研究山羊源novel_miR218对小反刍兽疫病毒(PPRV)在淋巴细胞的主要受体——淋巴细胞信号活化分子(SLAM)表达水平的调节作用,通过荧光定量PCR法和Western blot技术检测PPRV疫苗毒N75-1株接种山羊外周血单核细胞(PBMCs)中SLAM和novel_miR218表达变化以及病毒增殖水平,然后检测novel_miR218模拟物(novel_miR218mimic)和拮抗物(novel_miR218inhibitor)转染山羊PBMCs中SLAM表达水平变化及对PPRV增殖的影响。结果表明,山羊PBMC感染PPRV后24h(hpi)即可检测到细胞病变效应,特别在感染后48～72hpi尤为明显;与对照组相比,PPRV感染组中SLAM受体mRNA表达水平在24hpi极显著升高(P0.01),随后逐渐降低,而novel_miR218表达水平在24hpi极显著降低(P0.01),随后逐渐升高,对照组中novel_miR218和SLAM的mRNA表达水平在各检测时间点未发现显著变化;感染组中SLAM受体的蛋白表达规律与其mRNA表达相似,而PPRV-N蛋白的表达水平呈现不断增加的趋势;novel_miR218mimic转染组中SLAM和PPRV-N蛋白表达水平较对照组显著降低(P0.05或P0.01),且呈转染剂量依赖性,而novel_miR218inhibitor转染组中SLAM和PPRV-N蛋白表达水平较对照组显著升高(P0.05或P0.01),且呈转染剂量依赖性。结果表明,PPRV感染山羊PBMCs中novel_miR218和SLAM表达水平具有相关性,细胞转染检测结果提示novel_miR218对SLAM受体的表达水平具有负调控作用并影响PPRV在山羊PBMCs中的复制水平。     

猪圆环病毒2型感染PK-15细胞中外泌体的鉴定及其对细胞增殖和凋亡的影响

旨在分离感染PCV2的PK-15细胞分泌的外泌体,探讨其在PCV2感染淋巴细胞中的作用。提取PCV2感染PK-15细胞上清液中的外泌体,利用透射电镜观察外泌体形态、纳米颗粒跟踪分析测定外泌体粒径、Western blot检测外泌体标记蛋白分子（CD81、TSG101）;PKH67标记外泌体后检测细胞对外泌体的摄取;提取PCV2-外泌体基因组,检测PCV2 Rep和Cap基因;利用间接免疫荧光试验检测PCV2-外泌体感染PK-15细胞后PCV2病毒定位;通过绝对定量PCR检测PCV2-外泌体对淋巴细胞的感染率;利用CCK-8法检测淋巴细胞增殖;利用Annexin V-FITC/PI检测淋巴细胞凋亡率。透射电镜和外泌体粒径分析结果显示,PK-15细胞分泌的外泌体为双层膜的囊泡,直径30~200 nm;Western blot结果显示PK-15细胞分泌的外泌体存在特异性标记蛋白CD81和TSG101;外泌体摄取试验结果显示PCV2-外泌体能够被细胞摄取;PCR结果表明PCV2-外泌体基因组中含有PCV2 Rep和Cap基因;间接免疫荧光结果显示,与PCV2直接感染相比,PCV2-外泌体感染的淋巴细胞中,PCV2病毒拷贝显著升高,差异明显（P<0.01）,外泌体裂解后感染淋巴细胞能力与PCV2病毒无显著差异;PCV2-外泌体可显著抑制淋巴细胞增殖（P<0.01或P<0.05）;PCV2-外泌体显著提高淋巴细胞凋亡率。PCV2感染PK-15细胞的外泌体中携带病毒基因,感染淋巴细胞后使细胞增殖降低和细胞凋亡增加。     

线粒体融合蛋白2基因干扰与过表达对布鲁氏菌诱导巨噬细胞凋亡的影响

[目的] 试验旨在探究线粒体融合蛋白2（MFN2）基因干扰与过表达对布鲁氏菌诱导小鼠巨噬细胞凋亡的影响。[方法] 利用RNA干扰技术设计3条特异性针对MFN2基因的siRNA序列（siMFN2-450、siMFN2-1661、siMFN2-2275）和1条阴性干扰序列（siMFN2-Negative）;利用空质粒pcDNA3.1-EGFP通过过表达技术构建1个重组质粒pcDNA3.1-EGFP-MFN2。双酶切法鉴定过表达重组质粒pcDNA3.1-EGFP-MFN2,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测筛选最佳干扰序列并鉴定重组质粒的过表达效率,使用筛选出的最佳干扰序列和鉴定过表达后的重组质粒分别构建MFN2基因干扰及过表达的转染巨噬细胞模型;用牛种布鲁氏菌疫苗株A19侵染巨噬细胞,按照细菌数：细胞个数=100：1的比例侵染24 h,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）相关X蛋白（BAX）的表达情况,用流式细胞术检测细胞凋亡情况。[结果] 双酶切结果显示,pcDNA3.1-EGFP-MFN2过表达重组质粒构建成功;实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示,siMFN2-1661组MFN2的表达极显著降低（P<0.01）,pcDNA3.1-EGFP-MFN2组MFN2的表达极显著增加（P<0.01）,成功构建干扰及过表达MFN2基因的转染巨噬细胞模型;布鲁氏菌侵染干扰MFN2基因表达的巨噬细胞后,BAX蛋白表达水平显著高于siMFN2-Negative组（P<0.05）,BAX转录水平和细胞凋亡率极显著高于siMFN2-Negative组（P<0.01）;布鲁氏菌侵染过表达MFN2基因的巨噬细胞后,BAX的转录及蛋白表达水平均显著低于pcDNA3.1-EGFP组（P<0.05）,细胞凋亡率极显著低于pcDNA3.1-EGFP组（P<0.01）。[结论] 本试验结果表明,干扰MFN2基因的表达会增强布鲁氏菌诱导细胞凋亡的能力,而过表达MFN2基因则会抑制布鲁氏菌诱导细胞凋亡的能力,结果可为研究MFN2基因的生物学功能提供参考,为进一步解析布鲁氏菌的致病机制提供理论基础。     

山羊CREBZF蛋白两种亚型过表达载体的构建及其对子宫内膜上皮细胞凋亡的影响

旨在构建编码山羊CREBZF蛋白2种亚型（长亚型SMILE和短亚型Zhangfei）基因的过表达载体，并初步探究CREBZF对山羊子宫内膜上皮细胞（gEECs）凋亡的影响。本研究针对编码山羊CREBZF不同亚型的基因CDS区分别设计引物，分段进行PCR扩增；运用无缝克隆技术将所获得各目的基因片段与线性化pcDNA3.1（+）载体连接，构建pcDNA3.1（+）-SMILE和pcDNA3.1（+）-Zhangfei重组过表达载体，通过双酶切和测序进行鉴定；转染过表达载体至gEECs，提取总RNA和蛋白，通过qRT-PCR和Western blot验证过表达效率；应用流式细胞术检测过表达SMILE和Zhangfei对gEECs凋亡率的影响。PCR、双酶切显示各目的条带大小正确；测序显示目的片段与NCBI基因库中山羊CREBZF的预测序列一致性为100%；转染过表达载体后，gEECs中SMILE与Zhangfei在转录和翻译水平的表达量均显著增加，并发现SMILE可能在翻译后自身被修饰；空载体组细胞凋亡率为8.45%；转染pcDNA3.1（+）-SMILE组凋亡率显著上升至12.41%（P<0.01）；转染pcDNA3.1（+）-Zhangfei组凋亡率上升至9.83%，但相较于空载体组统计学差异不显著；结果提示，CREBZF可能调控gEECs的凋亡进程。本研究将目的基因分段克隆与无缝克隆技术联用，构建了上述2种过表达载体，为进一步探究CREBZF在反刍动物子宫内膜上皮细胞周期性变化中的作用奠定基础。     

山羊DGAT1基因的克隆及对前体脂肪细胞脂质沉积的调控作用研究

旨在克隆山羊DGAT1基因序列,明确DGAT1基因在山羊不同组织中的表达模式,并进一步揭示过表达DGAT1基因对山羊肌内前体脂肪细胞脂质代谢的影响。本试验以10月龄健康简州大耳公羊（n=7）为试验动物。采用RT-PCR法克隆山羊DGAT1基因序列,并对序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR （real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测DGAT1在山羊不同组织中的相对表达水平;采用双酶切法构建pcDNA3.1-DGAT1真核表达载体并转染至山羊肌内前体脂肪细胞;使用RT-qPCR检测DGAT1过表达效率及脂质代谢相关基因的表达情况;通过油红O染色法观察过表达DGAT1对脂滴形成的影响,利用GPO-Trinder酶学反应检测甘油三酯含量。结果显示,获得山羊DGAT1基因序列全长1 651 bp （GenBank登录号：MT221183）,包含5'UTR 125 bp,CDS 1 470 bp,3'UTR 56 bp,编码489个氨基酸残基;山羊DGAT1基因在小肠中的表达量最高,在脾中表达量最低;RT-qPCR检测结果显示,DGAT1在细胞中过表达极显著（P<0.01）,GPAM基因的相对表达水平显著上调（P<0.05）,ADRP和ACOX1基因极显著上调（P<0.01）,而AGPAT6基因相对表达水平显著下调（P<0.05）,MLYCD和HSL基因极显著下调（P<0.01）;油红O染色结果显示,过表达DGAT1后脂滴聚积相较于对照组极显著增多（P<0.01）,甘油三酯测定结果显示,过表达DGAT1基因可极显著增加山羊肌内脂肪细胞甘油三酯含量（P<0.01）。本研究成功获得山羊DGAT1基因CDS区序列并构建了pcDNA3.1-DGAT1真核表达载体,过表达DGAT1可显著促进山羊肌内前体脂肪细胞脂质沉积,并显著影响脂质代谢相关基因的表达,这些结果为进一步阐明DGAT1对调控山羊肌内脂肪代谢的作用机制提供了重要数据。     

慢病毒介导稳定表达增强小反刍兽疫病毒复制的山羊Vero/SLAM细胞系的建立

利用Gateway技术和慢病毒表达系统将山羊淋巴细胞信号活化因子SLAM稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,建立稳定表达可增强小反刍兽疫病毒(PPRV)复制的SLAM的Vero阳性细胞亚克隆,并验证阳性细胞亚克隆Vero/SLAM表达SLAM的活性、遗传稳定性及其对PPRV复制的增殖效果。分离山羊外周血淋巴细胞,提取基因组Total RNA,一步RT-PCR获得完整ORF的SLAM基因,采用BP及LR位点的基因重组技术,构建入门载体pDONR/SLAM并获得表达骨架pDEST/SLAM,与Packaging Mix pLP1、pLP2及VSV-G共转染293-FT细胞,获得SLAM复制缺陷型慢病毒样粒子,用其感染Vero细胞,杀稻瘟菌素抗性筛选获得阳性细胞克隆,通过靶标基因扩增、间接免疫荧光、激光扫描共聚焦显微技术、Western blot免疫印迹检测技术、致细胞病变效应及Realtime RT-PCR等技术分别验证SLAM基因组整合、转录,SLAM蛋白表达、反应活性以及PPRV在表达SLAM阳性细胞亚克隆上的增殖效果。结果显示:SLAM受体基因被稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,该受体蛋白表达于细胞周质,建立的细胞连续传代不丢失,接种病毒后致细胞病变时间由4～7d缩短为3.5d,TCID₅₀·0.1mL^-1由4.25增加为5.67,相对于正常Vero细胞,整合有SLAM的Vero细胞,由于表达了PPRV特异的细胞受体使PPRV对其易感性显著增强。成功建立一株稳定表达靶向增强PPRV复制的Vero/SLAM细胞:该细胞表达的SLAM具有明显增强PPRV复制的功能,不仅可以从细胞模型水平阐明增强PPRV复制的关键靶基因,也为PPRV感染引起宿主细胞的变化以及对机体的致病机制等提供研究工具。     

过表达NR4A1促进山羊皮下脂肪细胞分化

旨在克隆山羊NR4A1基因的CDS区序列,明确其组织和细胞表达模式,以及探究过表达NR4A1基因对山羊皮下脂肪细胞分化的影响。本试验利用双酶切法构建山羊过表达载体pcDNA3.1-NR4A1。以1周岁简州大耳羊（n=5）为试验动物。利用RT-PCR方法和实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）技术克隆NR4A1基因编码区序列并明确其时空表达特性,再将山羊pcDNA3.1-NR4A1载体转染皮下脂肪细胞使NR4A1过表达,利用形态学方法检测过表达后脂滴聚集的变化,同时采用qPCR方法检测脂肪分化标志基因相对表达水平的变化。结果获得山羊NR4A1基因的编码区序列是1 797 bp,编码598个氨基酸;NR4A1在山羊各组织中广泛表达,且在山羊背最长肌中的相对表达水平最高（P<0.01）,在山羊皮下脂肪细胞分化60 h表达量最高（P<0.01）;过表达NR4A1基因显著促进山羊皮下脂肪细胞的脂滴积累,并且显著提高C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、LPL、SREBP1和AP2的相对表达水平（P<0.05）。NR4A1基因可能是山羊皮下脂肪细胞分化的正调控因子,且可能是协同脂肪分化标志基因的表达量来实现的。     

PPRV受体信号转导淋巴细胞激活分子V区功能蛋白的表达及活性分析

信号转导淋巴细胞激活分子(SLAM)是小反刍兽疫病毒(PPRV)感染宿主的主要细胞受体,其N端V结构域的表达活化可以启动PPRV的入侵感染。本试验选用Slam/V结构域作为功能靶标进行表达,并分析其活性。分离山羊外周血淋巴细胞,提取其基因组RNA,应用RT-PCR方法扩增山羊SLAM/V基因,构建原核表达载体pGEX-6P-1/Slam/V。将获得的重组质粒pGEX-6P-1/Slam/V转化BL21(DE3)感受态细胞,通过SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和验证。结果显示,IPTG诱导浓度为0.1 mmol/L、37℃,诱导14h时,靶标蛋白表达量最高,融合蛋白相对分子质量约为39 800,且主要以包涵体形式存在。经山羊抗人SLAM蛋白多克隆抗体识别鉴定,证实其具有良好的免疫反应活性。本试验为建立稳定表达山羊SLAM/V功能区的阳性细胞克隆及PPRV侵染路径研究奠定了基础。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂对小反刍兽疫病毒复制的影响

旨在探究组蛋白去乙酰化酶抑制剂对小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)复制的影响，以确定组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)在PPRV复制过程中的作用。采用RT-qPCR法检测PPRV感染后Vero细胞HDACs(HDAC1~11) mRNA表达水平的变化；用针对不同类型HDACs的抑制剂处理感染PPRV的Vero细胞48 h，Western blot筛选影响PRPV N蛋白表达的抑制剂；应用筛选出的抑制剂处理感染PPRV的Vero细胞，通过RT-qPCR、Western blot和TCID₅₀法进一步分析抑制剂对病毒RNA、蛋白和病毒滴度的影响。结果显示，PPRV感染后，Vero细胞HDAC2 mRNA水平显著升高(P<0.05)；SAHA、TMP269、MGCD0103处理后，PPRV N蛋白的表达量明显降低，且呈剂量负相关；SAHA、TMP269、MGCD0103也显著降低PPRV N RNA表达水平(P<0.05，P<0.05，P<0.01)和病毒滴度(P<0.05,P<0.05,P<0.01)。这表明Ⅱa类HDACs抑制剂和Ⅰ类HDACs抑制剂能抑制PPRV的复制，Ⅰ类HDACs (HDAC1~3)和Ⅱa类HDACs (HDAC4~5、HDAC7、HDAC9)可能参与调控PPRV的感染。     

Effect of Exosomes Derived from PPRV Vaccine Strain N75-1 Infected Cells on the Expression of SLAM in Goats

Signaling lymphocyte activation molecule (SLAM) was identified as the primary receptor of Peste des petits ruminants virus (PPRV) on goat lymphocytes. This study aimed to explore the effects of exosomes derived from PPRV vaccine strain N75-1 infected cells on the expression of SLAM in goats. In this study, SLAM expression and cytokines expression levels of goat PBMCs (recipient cells) incubated with exosomes isolated from PPRV-infected goat PBMCs (Exo-PPRV) was analyzed by quantitative real-time PCR, flow cytometric assay and Western blot assay. The results showed that the recipient cells treated with Exo-PPRV had significantly increased SLAM mRNA and cell surface expression (P<0.05) as compared with Exo-Mock treated cells. Furthermore, the increased TNF-α, IL-10, and IFN-γ expression as well as decreased IFN-α expression (P<0.05) were also detected. Further study demonstrated that Exo-PPRV that contained high levels of PPRV H protein could transmit H protein to recipient cells. Moreover, the expression level of SLAM in the pcDNA3.1-H transfected cells was significantly higher than that in the pcDNA3.1 transfected cells and non-transfection group. Taken together, our study demonstrated that PPRV infected cells derived exosomes has positive effects on the SLAM expression in the recipient cells, and that the high level of PPRV H protein contained in PPRV-Exo is one of the key molecules for exosomes to regulate the expression of SLAM in the recipient cells.     

稳定表达山羊SLAM受体的Vero细胞系的建立

信号淋巴激活分子（signalling lymphocyte activation molecule, SLAM）又称CD150,是小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus, PPRV）和犬瘟热病毒（canine distemper virus, CDV）等麻疹病毒属病毒感染淋巴细胞的主要受体,在病毒侵入细胞中发挥着重要作用。为了建立稳定表达山羊SLAM真核细胞系,本研究将全基因合成的gSLAM基因克隆至真核表达质粒pIRES2-GFP中,构建了重组质粒pIRES2-gSLAM。将该重组质粒转染非洲绿猴肾细胞（Vero）,经G418筛选后,筛选到稳定表达gSLAM基因的细胞系Vero-gSLAM,该细胞系在传代至第10代,仍能稳定表达gSLAM基因,PPRV N75/1病毒株可以感染且能形成明显的细胞病变（CPE）,相比在Vero细胞上10^-4.65 TCID₅₀/0.1 mL的毒价,在Vero-gSLAM上为10^-5.75 TCID₅₀/0.1 mL,其毒价有所提高。该细胞系可用于PPRV强毒分离和致弱机制等相关研究。     

Establishment of Vero Cell Line Expressing Goat SLAM Receptor Stably

Signalling lymphocyte activation molecule (SLAM,also called CD150) serves as a main cell receptor for PPRV (peste des petits ruminants virus).This study was aimed to establish a cell line,using Vero cells as the parental cell,to express goat SLAM stably,which could be used to isolate and propagate PPRV.The gene encoding goat SLAM in vitro was synthesized and cloned into eukaryotic expression vector pIRES2-GFP,and the recombinant expression plasmid pIRES2-gSLAM was obtained.The positive stably transfectant Vero-gSLAM cells were screened by G418 and identified by immunofluorescence(IF) and RT-PCR.The result of virus titration by Vero-gSLAM cell line showed that PPRV strain N75/1 had a titre of 10^-4.65 TCID₅₀ per 0.1 mL in Vero cell at 5 day after infection and the titre of PPRV N75/1 strain was 10^-5.75 TCID₅₀ per 0.1 mL in Vero-gSLAM cells.The cell line would play an active role in virus isolation,biological characteristics study and vaccine virus production of PPRV.     

山羊生物钟基因CLOCK真核表达载体的构建和生物信息学分析

试验旨在构建山羊昼夜运动输出周期蛋白(circadian locomotor output cycles kaput,CLOCK)基因真核表达载体,系统分析山羊CLOCK蛋白的生物学特性。从山羊卵巢组织中提取总RNA,反转录成cDNA后经PCR扩增山羊CLOCK基因CDS区序列,并以同源重组的方式将其连接至pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体;经PCR、酶切和测序鉴定后,将阳性质粒命名为pcDNA3.1-3HA-gCLOCK;将pcDNA3.1-Puro-N-3HA和pcDNA3.1-3HA-gCLOCK质粒分别转染至HEK293T细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测山羊CLOCK基因的表达效果,并对山羊CLOCK基因进行系统的生物信息学分析。结果显示,山羊CLOCK基因CDS区片段长2 538 bp,将其与线性化的pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体重组连接并通过酶切和测序鉴定后,成功构建了pcDNA3.1-3HA-gCLOCK真核表达载体;实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,pcDNA3.1-3HA-gCLOCK转染组CLOCK基因在mRNA和蛋白水平的表达量均极显著高于pcDNA3.1-Puro-N-3HA对照组(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,山羊CLOCK基因CDS区序列与绵羊、牛和马的相似性分别为99.4%、98.7%和95.6%。山羊CLOCK蛋白是一种不稳定蛋白,具有一定的亲水性,无跨膜区和信号肽。二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成;三级结构与小鼠和人的CLOCK蛋白相比具有极高的相似性。本研究成功构建了山羊生物钟基因CLOCK真核表达载体,并进行了生物信息学分析,为进一步研究山羊CLOCK基因的生物学功能及山羊生物钟的转录调控机制提供了材料。     

山羊RORα基因的克隆、表达载体构建及功能分析

旨在克隆山羊维甲酸相关孤儿受体α(RORα)基因并构建其真核表达载体,然后利用生物信息学工具系统分析RORα的生物学特性,最后对其在山羊生物钟系统中的作用机制进行初步探究。本研究以1只健康的12月龄雄性西农萨能奶山羊为试验动物,提取其肝组织总RNA,经逆转录PCR反转录为cDNA后,利用常规PCR扩增山羊RORα基因的编码区(coding sequence,CDS)片段,使用同源重组法将其与pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体相连接; 重组载体经PCR、酶切和测序鉴定后,将阳性质粒命名为pcDNA3.1-3HA-gRORα; 将pcDNA3.1-Puro-N-3HA和pcDNA3.1-3HA-gRORα质粒分别转染至HEK293T细胞后,通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)和蛋白质免疫印迹(western blotting,WB)技术检测山羊RORα的表达; 同时利用ExPASy、ProtScale等软件对山羊RORα基因进行系统的生物信息学分析。另外,使用同源重组法分别构建含有山羊生物钟基因BMAL1和NR1D1启动子片段的pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc及pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc的荧光素酶报告质粒,并通过双荧光素酶报告试验探究山羊RORα蛋白调控BMAL1和NR1D1基因启动子转录活性的作用机制。PCR、酶切和测序鉴定结果表明,pcDNA3.1-3HA-gRORα重组质粒构建成功; qPCR和WB结果显示,pcDNA3.1-3HA-gRORα转染组RORα基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平均显著高于pcDNA3.1-Puro-N-3HA转染组(P < 0.01)。生物信息学分析结果显示,山羊RORα基因CDS区序列与绵羊、牛和猪的相似性较高,分别为97.5%、97.1%和95.2%。山羊的RORα蛋白是一种亲水性蛋白。二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,有信号肽的概率较小,无跨膜区; 三级结构与小鼠和人的RORα蛋白差异性极小,三者具有高度相似性。此外,PCR、酶切和测序结果表明,pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc和pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc重组质粒构建成功。双荧光素酶报告试验结果表明,山羊RORα蛋白可以显著上调山羊BMAL1和NR1D1基因启动子的转录活性。本研究成功构建了山羊RORα基因的真核表达载体,并证明了RORα蛋白可以正向调控山羊BMAL1和NR1D1基因的启动子活性,这为进一步探究山羊核受体RORα的功能及山羊生物钟的转录调控机制提供了前期基础。     

乙型脑炎病毒NS1和NS1-2A蛋白的真核表达及其差异性研究

为深入研究乙型脑炎病毒（JEV）NS1和NS1-2A蛋白的表达和免疫效果差异,本试验构建并扩增C-端含Flag标签的NS1和NS1-2A基因,利用T4 DNA连接酶分别连接到质粒pcDNA3.1（+）上,构建重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag。将这两种真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,利用RT-PCR、IFA和Western blotting检测NS1和NS1-2A蛋白在体外的表达情况,用pcDNA3.1-NS1-Flag、pcDNA3.1-NS1-2A-Flag和pcDNA3.1（+）免疫BALB/c小鼠,检测这两种蛋白在体内的表达差异。结果显示,试验成功构建了NS1和NS1-2A基因的真核表达载体pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag,IFA和Western blotting鉴定NS1和NS1-2A蛋白成功表达,重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠后可诱发机体产生特异性体液免疫,pcDNA3.1-NS1-2A-Flag联合免疫组小鼠血清抗体效价和INF-γ细胞因子分泌水平比pcDNA3.1-NS1-Flag免疫组高,且与pcDNA3.1（+）空载体免疫组差异极显著（P<0.01）;pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫组小鼠体内的INF-γ分泌量会增多,免疫第4周达到最高后逐渐降低。pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠能够刺激JEV特异性抗体的分泌和增强机体的细胞免疫功能,且NS1-2A联合基因的免疫效果优于NS1单一基因,为进一步研究JEV的非结构蛋白功能、研发NS1和NS1-2A基因疫苗奠定基础。     

猪子宫腔液外泌体来源的TIMP2蛋白对胚胎附植的影响

旨在研究猪子宫腔液外泌体来源的TIMP2蛋白对妊娠早期胚胎附植的影响.本研究采用超速离心法分离妊娠第9天(n=3)和第12天(n=3)大白猪子宫腔液外泌体,利用Western blot(WB)检测外泌体中TIMP2蛋白的变化,并通过免疫组化试验研究TIMP2蛋白在子宫中的表达定位.进一步用外泌体与猪胚胎滋养层细胞(po...