传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP3基因的克隆与原核表达

利用PCR技术扩增出IBDV的结构蛋白VP3基因，将其克隆到表达载体pPRO^EX-HTa中，获得重组质粒命名为VP3／PA，经PCR、酶切和序列分析鉴定表明，插入的位置、大小和读码框均正确。SDS—PAGE检测表明，经重组质粒VP3／PA转化、诱导的受体菌E．coli DH5 α能表达结构蛋白VP3基因，约33 Ku，表达量达到了茵体总蛋白的33．9％，经Western blot等检测表明，诱导表达的抗原蛋白能与vvIBDV阳性血清发生特异性反应。这为IBDV血清学诊断方法的建立打下了基础。     

重组猪瘟病毒E2基因逆转录病毒载体的构建及其表达活性

从实验感染兔脾组织中提取总RNA，应用RT—PCR得到了CSFVC-株结构蛋白E2基因，定向克隆于逆转录病毒载体pBABEpuro，经PCR、酶切和序列分析鉴定，获取阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒载pVSV—G共转染GP2—293细胞，收获假型病毒，并在Polybrene的介导下感染PK15细胞，嘌呤霉素筛选表达猪瘟E2基因的细胞株。通过细胞传代并结合PCR、免疫荧光及ELISA检测表明，所筛的细胞细胞系能稳定表达猪瘟E2基因，而且表达产物具有良好的生物学活性。     

猪瘟病毒E0蛋白的表达与抗原性研究

本研究采用PCR技术,扩增猪瘟病毒E0蛋白191～227氨基酸基因片段,将其克隆到表达载体pET-30C质粒中,获得重组质粒30C-E0-1725。经酶切、PCR、序列分析,证明插入的目的基因有正确的编码框架。Westernblot试验表明,利用大肠杆菌表达的目的蛋白,能与CSFV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原特异性。     

猪瘟病毒E2蛋白部分抗原区基因在原核系统的分泌表达与鉴定

基于猪瘟病毒主要保护性抗原E2囊膜糖蛋白有两个相对独立的抗原结构单位B/C抗原区和A/D抗原区,根据GeneBank中猪瘟病毒B/C基因核苷酸序列设计合成一对引物,经RT-PCR扩增猪瘟病毒B/C基因。将扩增所得猪瘟病毒B/C基因克隆于PMD18-T载体,然后定向亚克隆猪瘟病毒B/C基因至原核表达载体PET30(a)的多克隆位点中,经酶切鉴定后,将含有B/C基因的重组质粒命名为PETB/C。用PETB/C转化受体菌BL21,挑取单个菌落,用诱导剂IPTG以不同浓度进行诱导,并在不同诱导时间收集样品。经SDS-PAGE电泳分析证实B/C基因获得了表达,并在终浓度为1mM的IPTG,诱导6h其表达达到高峰,经Western-blot分析证实表达的重组B/C蛋白具有反应活性,大小约为9KD。用表达产物作ELISA,结果表明表达产物与猪瘟病毒抗血清可发生明显的反应,而与其它8种疫病阳性血清不发生反应。正常菌体蛋白与猪瘟病毒阳性血清也不发生反应。通过对58份送检血清样品的检测结果显示其与Dot-ELISA的相符率高达95%以上。试验证明利用原核表达系统制备的重组蛋白作为诊断用抗原,为研究亚单位疫苗或诊断抗原打下坚实基础。     

猪瘟病毒表面抗原E2基因的克隆与原核表达

为获得可用于诊断的猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白重组抗原,对CSFV-E2的多个B细胞抗原表位进行重构和表达。将人工合成的E2蛋白多抗原表位基因与p ET-28a(+)载体连接后,转化至宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析蛋白可溶性,His亲和层析柱纯化蛋白并进行抗原性检测。重构后的猪瘟病毒E2基因多抗原表位基因大小约500 bp,PCR、双酶切鉴定结果显示与预期相符;重组蛋白为可溶性表达,大小约23 k Da;Western blot结果显示,重组蛋白可与猪瘟阳性血清发生特异性结合,具有良好的免疫反应性,可作为诊断抗原用于猪瘟病毒感染动物的血清抗体检测。     

猪瘟病毒E2基因在毕赤酵母中的表达

猪瘟是严重危害养猪业的一种烈性传染病,病死率高,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物疫病。E2蛋白是猪瘟病毒中最主要的保护性抗原,因此,围绕E2的基因工程疫苗研究已成为热点。本研究以含有猪瘟E2基因的重组质粒pMD18-T-E2为模板,设计一对特异性引物扩增去除跨膜区的E2基因,将PCR产物插入巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαA-E2,将该质粒用SacⅠ酶切线性化后,电穿孔导入巴斯德毕赤酵母X-33中,经Zeocin筛选得到高拷贝转化子,通过甲醇诱导表达、SDS-PAGE和Western bolt试验验证,结果表明E2蛋白在酵母中获得成功表达。     

瘦蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用 RT- PCR方法从猪脂肪组织扩增出瘦蛋白基因 ,将其插入 p MD1 8- T克隆载体 ,经序列分析证明 ,所获得的目的基因为 4 4 1 bp,与预期大小一致。提取质粒后用 Eco R 和 Xho 双酶切 ,克隆入 p ET- 2 8a表达载体 ,将阳性重组质粒转化表达受体菌 E.coli BL 2 1 ( DE3) ,经 IPTG诱导 ,SDS- PAGE检测 ,证明在 E.coli BL 2 1中正确表达了重组猪瘦蛋白     

猪瘟病毒E2蛋白A-D抗原表位区的原核表达与蛋白纯化

为制备具有活性的猪瘟ELISA抗体检测试剂盒包被抗原,本研究将猪瘟病毒E2蛋白主要抗原表位区A-D部分基因插入表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-E2AD,将其转化至大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达。对IPTG浓度和诱导时间进行优化,确定在37℃条件下、IPTG终浓度为0.2 mmol/L时诱导表达4 h,E2AD蛋白的表达量最高。通过对包涵体的纯化条件进行摸索,最终获得目的蛋白的浓度为0.2 g/L。Western blot分析结果显示,E2AD蛋白能够被猪瘟阳性血清特异性识别,表明纯化后的E2AD蛋白具有良好的反应原性。该结果为进一步开展猪瘟ELISA抗体检测试剂盒的研制工作奠定了基础。     

猪瘟病毒E2蛋白抗原多肽与T4噬菌体SOC蛋白的融合表达

利用DNA重组技术将猪瘟病毒（clasical swine fever virus,CSFV)E2蛋白主要抗原编码区基因（mE2)与T4噬菌体SOC基因融合，插入T4噬菌体表达质粒，构建成T4噬菌体SOC位点表达mE2的表达载体plSmE2。将其转化至BL21（DE3）菌，取经IPTG诱导后表达的目的蛋白SDC-mE2进行SOS-PAGE，薄层凝胶扫描分析、Western blot及ELISA等方法检测。结果表明，表达的SOC-nE2蛋白相对分子质量约25700，表达量占菌体总蛋白量的36.7%，并具有与CSFV特异性抗体反应的活性。     

猪瘟病毒E2糖蛋白A1亚区抗原性分析

采用Bac—to—Bac杆状病毒表达系统，对猪瘟病毒A抗原区内的2744-2947nt基因片段(EC)进行了克隆、表达，并分析了表达产物的抗原性。研究发现，EC表达产物能与抗猪瘟病毒Alfort毒株E2蛋白的中和性单克隆抗体c2410、a18发生特异性结合，且用其免疫动物后能诱导机体产生中和抗体。结果表明，A1抗原亚区位于E2蛋白791～858位氨基酸区域。     

猪瘟病毒山东惠民分离株E2基因的克隆及表达

从山东惠民某猪场病料中经RT-PCR扩增了猪瘟病毒（CSFV）E2基因,并将其克隆到pMD18-T载体。经序列测定,E2基因核苷酸序列长度为1 065bp,与GenBank中CSFV石门毒株（SHIMEN）、猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）、猪瘟ZJ7分离株E2基因核苷酸序列同源性分别为85.1%,84.2%,98.8%;氨基酸序列同源性分别为91.5%,91.5%,98.6%。将E2基因插入到大肠杆菌原核表达载体pGEX-KG,获得重组质粒pKG-E2,再转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导,受体菌能表达大小约为65 000的蛋白。Western blot显示表达的蛋白具有反应原性。     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区原核表达载体的构建及表达

用RT-PCR技术对猪瘟兔化弱毒C株、石门强毒株(Shimen)、近期地方流行的属于第1群毒株的新疆毒株(XJ)和第2群代表毒株甘肃临洮(LT)株E2基因的主要抗原区进行扩增，均得到约561bp的基因片段；经克隆测序及序列分析，该基因编码187个氨基酸残基，预计蛋白分子质量为21.7ku。将这4个基因分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，经酶切、PCR扩增和测序分析确证其正确插入到表达载体中，阅读框是正确的，从而构建成重组表达载体。重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中，用异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，对表达的蛋白用SDSPAGE电泳、免疫印迹和薄层凝胶扫描分析。结果表明，E2基因的主要抗原区可以在大肠埃希氏菌中表达，表达的蛋白多以包涵体形式存在，表达产物的分子质量约为50．0ku，与理论推测的分子质量一致；薄层凝胶扫描分析表明。表达蛋白约占菌体蛋白总量的20．1％；免疫印迹结果证明，表达的E2蛋白可被猪瘟阳性血清所识别。     

新城疫病毒核衣壳蛋白基因在大肠埃希菌中的表达、纯化及其活性分析

构建新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)基因的原核表达载体,并将其在宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中表达。以NDV La Sota株NP基因序列为模板,设计特异性引物,通过PCR扩增获得NP蛋白全长基因片段,定向插入原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-NDV NP;将构建的重组质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,表达出目的蛋白,并采用亲和层析的方法纯化表达蛋白;表达蛋白采用Western blotting方法检测其反应原性。结果显示,成功克隆了新城疫病毒NP基因全长,片段序列1470 bp;构建的pET-NDV NP载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误;转化表达宿主菌后经SDS-PAGE检测结果显示目的基因得到成功表达,且表达蛋白经Ni-NTA镍离子亲和层析法被成功纯化,蛋白质浓度为3 mg/mL;Western blotting检测结果显示表达蛋白具有良好的反应原性。试验结果表明,成功构建了含有新城疫病毒核衣壳蛋白基因的原核表达载体,成功表达、纯化得到了NDV NP蛋白。     

猪瘟病毒蛋白E2、N^pro基因的克隆表达及纯化

克隆了猪瘟病毒（CSFV）石门株E2和Npro基因,并分别插入pGEX-6p-1表达载体中,构建了原核重组表达质粒。经IPTG诱导后,应用SDS-PAGE电泳检测结果表明,重组质粒均得以成功表达。使用超声法破碎菌体获得蛋白,将带有GST标签的融合蛋白进行亲和层析,其中E2和Npro的表达形式分别为包涵体表达和可溶性蛋白表达。将E2变性后重折叠,应用亲和层析法纯化蛋白,Western blot检测发现CSFV蛋白E2能够被CSFV阳性血清识别,具有良好的反应原性,而Npro不能与CSFV阳性血清反应。     

猪瘟病毒蛋白E2、Npro基因的克隆表达及纯化

克隆了猪瘟病毒(CSFV)石门株E2和Npro基因,并分别插入pGEX-6p-1表达载体中,构建了原核重组表达质粒。经IPTG诱导后,应用SDS-PAGE电泳检测结果表明,重组质粒均得以成功表达。使用超声法破碎菌体获得蛋白,将带有GST标签的融合蛋白进行亲和层析,其中E2和Npro的表达形式分别为包涵体表达和可溶性蛋白表达。将E2变性后重折叠,应用亲和层析法纯化蛋白,Western blot检测发现CSFV蛋白E2能够被CSFV阳性血清识别,具有良好的反应原性,而Npro不能与CSFV阳性血清反应。     

猪瘟病毒贵州流行株E2基因原核表达及其免疫原性的研究

本研究根据GenBank登录的猪瘟病毒Shimen和C株的E2基因序列设计1对特异引物,采集来自贵州的疑似猪瘟病死猪组织,提取总RNA,进行RT-PCR扩增,将扩增产物测序后进行核苷酸序列比较分析.并将RTPCR产物克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒pMD18-T-E2,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将E2基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,成功构建猪瘟病毒E2基因原核表达质粒pET-32a-E2,将构建好的原核表达质粒pET-32a-E2转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳、Western blot分析,得到了约58 ku的条带,与预期大小相符,进一步提取、纯化目的蛋白,将目的蛋白加入弗氏佐剂免疫小鼠,免疫后采血检测抗体,结果显示目的蛋白能诱导小鼠产生一定抗体水平,该研究为猪瘟亚单位疫苗的研究奠定了基础.     

猪瘟病毒E2糖蛋白A1抗原亚区的表达

猪瘟病毒(CSFV)囊膜结构糖蛋白E2(gp55)是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白。E2存在4个不同抗原区(A-D)，根据中和特性和保守性差异，将A抗原区进一步划分为A1、A2、A3抗原亚区，A1抗原亚区在不同猪瘟病毒分离毒株中高度保守且诱导的单克隆抗体具有中和特性。本采用pRSET C载体，对A抗原区2744nt～2947nt(791aa～858aa)基因片段(EC)进行克隆、表达，并分析表达产物的免疫反应性。研究发现：EC表达产物能与抗猪瘟病毒Alfort毒株E2蛋白的中和性单克隆抗体c2410发生特异性结合，且此结合能被猪瘟病毒抗原或阳性血清阻断。结果表明：A1抗原亚区位于E2蛋白791～858位氨基酸区域。     

委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

原核表达并纯化委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)E2蛋白胞外区,并以此为抗原免疫动物制备多克隆抗体。利用PCR扩增VEEV E2蛋白胞外区基因并将其插入到原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达。优化诱导条件并对目的蛋白进行亲和纯化,用纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光方法检测抗体的结合能力。通过PCR扩增出约为1 023bp的VEEV E2基因胞外区,成功构建重组表达质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,在37℃,0.6mmol/L IPTG诱导3h条件下目的蛋白表达量最高且主要以包涵体形式存在;将纯化的目的蛋白免疫BALB/C小鼠成功制备了抗VEEV E2蛋白胞外区鼠源多克隆抗体,经间接免疫荧光鉴定制备的抗体能够特异性识别真核表达的VEEV E2蛋白。VEEV E2基因胞外区在大肠杆菌中获得稳定表达,且表达的目的蛋白具有良好的免疫原性,为VEEV快速诊断方法及新型疫苗的研究奠定了基础。     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区表达及Dot-ELISA建立研究

为建立基于猪瘟病毒E2基因主要抗原区表达产物的猪瘟抗体斑点杂交ELISA方法,应用RT-PCR方法扩增了猪瘟病毒E2基因的主要抗原区(dE2),经EcoR I、Xho I双酶切,与经同样双酶切的原核表达载体pET-28a (+)连接,加入适量IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,成功表达的重组蛋白分子量约32.4 KDa,能与CSFV阳性血清特异性结合,为CSFV抗体检测提供了有效工具。     

猪瘟病毒E2蛋白抗原表位的表达与免疫活性研究

以猪瘟病毒全长基因组质粒为模板,PCR扩增出E2囊膜糖蛋白上A/D抗原区B细胞表位878aa～938aa;PCR扩增片段连接到pET-32a( )载体构建pET-AD原核表达质粒,将阳性质粒转化到BL21大肠埃希菌中诱导表达,以Ni-NTA亲和柱纯化,纯化后的蛋白进行Western blot鉴定。结果表明,重组质粒pET-AD在BL21大肠埃希菌中可以高效表达,表达的蛋白质经纯化后仍然有反应原性。