饲料中鱼源性成分真实性鉴别研究

研究旨在建立标准化的饲料中鱼源性成分的PCR检测方法,以形成行业标准推广使用.应用鱼源性引物对35种鱼类、24种非鱼类动物和10种植物样品进行PCR检测,只在35种鱼类中出现224 bp特异扩增条带,在其他的非鱼类动植物DNA中未出现扩增条带.实验表明,PCR检测方法具有特异性,检测限为0.1 ng DNA和0.1 %(W/W).应用该方法对上海口岸进口的100个鱼粉样品进行检测,均能检出鱼源性成分.研究建立的标准化饲料中鱼源性成分PCR检测方法能应用于日常检验检疫工作,可推广使用.     

动物产品中猪源性和牛源性成分双重荧光PCR检测方法的建立

[目的]建立双重荧光PCR法,检测动物产品中猪、牛源性成分。[方法]分别针对猪、牛线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）种间保守基因,设计特异性引物与探针,通过对反应体系和反应条件的优化筛选,建立了双重荧光PCR方法,在同一个荧光PCR反应中完成2种动物源性成分的检测。并对该方法的特异性、敏感性进行评估。[结果]对16种不同的动物DNA进行检测．仅猪、牛源性成分收集到相应的典型的S型扩增曲线,对猪、牛二联模板的检测,可同时收集到相应模板的扩增曲线．其余14种动物源性成分未发现扩增曲线。双重荧光PCR对猪肉、牛肉模板的最低检出限均为10^-5,与相应的单重荧光PCR方法的检出限一致。[结论]该方法特异性强,敏感性高,适用于肉制品、奶制品、饲料等动物源性产品的检测。     

动物产品的DNA提取方法

采用以异硫氰酸胍法为基础的提取方法分别提取牛肉、山羊肉、鸡肉、猪肉干、鱼粉、牛奶粉、牛奶、鱼油以及牛油中的DNA,18S rDNA片段的PCR扩增结果表明各样品已提取到DNA,且DNA中不含抑制PCR的物质。牛肉、牛奶粉、牛奶、加入牛肉DNA的鱼油和牛油的牛源性成分PCR检测结果为阳性;山羊肉和加入山羊肉DNA的鱼油的羊源性成分PCR检测结果为阳性;牛、羊源性成分PCR产物经酶切鉴定为非假阳性。这些结果显示本研究建立的动物产品DNA提取方法是可行的。     

饲料中鸡源性成分PCR-DHPLC检测方法的建立

以鸡组织为材料,提取鸡组织的线粒体DNA,以鸡12SrRNA基因为靶基因设计引物,PCR反应扩增片段230bp;用13种畜禽和水产动物线粒体DNA验证该PCR引物的特异性,结果只有鸡线粒体DNA为阳性;PCR-DHPLC检测灵敏度在DNA水平上达到了2.04mg/L;在随机采集的22份饲料样品中,检出8份鸡源性成分样品。结果表明,本研究建立的PCR-DHPLC方法可特异、灵敏地对饲料中的鸡源性成分进行快速准确检测。     

饲料中牛、羊源性成分现场可视化检测方法的建立

根据牛、羊线粒体中物种特异性序列设计引物,应用可视化环状等温扩增技术（visual loop-mediate isothermal amplification,vLAMP）对牛、羊源性成分进行快速扩增及可视化判断,同时建立牛、羊源成分人工污染的饲料模型,考察vLAMP检测方法的灵敏度。结果表明,牛源性引物和羊源性引物仅分别对牛、羊源性成分产生特异性扩增,灵敏度高达0.001%。本试验所建立的牛、羊源性成分现场可视化筛查方法具有较高的特异性与灵敏度,操作简单、快速,可用于饲料中牛、羊源性成分污染和食品掺伪的现场可视化检测。     

麝属动物源性成分PCR检测方法的建立

为了对麝属动物源性成分进行有效鉴定,根据麝属动物线粒体DNA(mt DNA)序列,使用分子生物学软件Oligo7.0设计了特异性引物,用来建立PCR检测麝属动物源性成分的方法。结果显示:使用麝特异性引物优化的PCR体系可以对两份麝样品进行扩增,凝胶电泳均出现特异性条带。方法特异性好,只扩增麝属动物样品,16份其他物种的样品均为阴性结果。方法灵敏度较高,可检测到100个拷贝DNA的数量级。表明本研究建立的方法可应用于动物组织及其加工产品中的麝属动物源性成分的检测。     

饲料中马、驴源性成分的分子生物学检测技术

根据马、驴线粒体DNA中的保守区段设计了一对引物，通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）可以专一地检测扩增出马、驴源性成分的DNA片段，再经限制性内切酶Sau 3A和Alu Ⅰ的酶切鉴定可以区分马源性成分和驴源性成分．PCR扩增产物的测序结果验证了酶切鉴定结果的正确性。引物灵敏度测试培果表明该方法的检测低限均达0．3％．该对引物可以成为检测马、驴源性成分高效准确的检测工具。     

肉制品中牛源性成分PCR检测方法的建立及其应用

根据牛特异性线粒体DNA片段,设计合成1对引物,以生、熟牛肉为材料,建立了肉制品中牛源性成分的PCR检测方法,并用该法对市售的67份牛肉制品进行检测。结果显示,所检牛源性成分在271 bp处出现预期的条带,扩增片段经Sau3AⅠ酶切分析确认,获得的214和57 bp片段与预期一致;运用该引物均可扩增出水牛肉、牦牛肉、奶牛肉、黄牛肉单一的相同大小的DNA条带,而对羊、马、狗、驴、兔和鸭等14种动物肉的DNA扩增则呈阴性,其检测灵敏度达到53.2 fg/μL DNA;利用该法对67份牛肉制品进行检测,检出率为100％。结果表明,该法快速简便,且具有较高的特异性和敏感性,可用于市售牛肉制品中牛源性成分的鉴定。     

牛源乙肝病毒套式PCR检测方法的建立及其S靶基因同源性分析

为建立牛源乙肝病毒(HBV)套式PCR检测方法,本研究根据GenBank中人HBVS基因,设计2对引物,通过对PCR反应条件进行优化,建立检测牛源HBV的套式PCR检测方法,并进行S基因片段序列同源性和系统发育进化树分析。结果表明:该方法第1次PCR扩增的敏感性是1.00pg,第2次PCR敏感性是0.32fg,扩增产物分别为509bp、240bp,而牛病毒性腹泻病毒、丝状支原体丝状亚种SC型、牛结核分枝杆菌的扩增结果均为阴性。牛源HBVS基因片段序列与GenBank中人HBVS基因进行比对,核苷酸同源性98.8%～99.4%,氨基酸序列同源性97.1%～98.3%。研究表明建立的牛源HBV套式PCR具有很好的特异性和敏感性,可用于牛源HBV的检测,并对进一步研究牛源HBV与人HBV之间的关系奠定了基础。     

实时荧光PCR法检测饲料中牛、羊源性成分

为了快速准确地检测饲料中牛、羊源性成分,试验采用实时荧光PCR方法,分别以牛、羊各自物种特异性基因为研究对象,设计实时荧光PCR扩增的特异性引物及探针,建立饲料中牛、羊源性成分的实时荧光PCR检测方法。结果表明:该检测方法特异性强、灵敏度高(达到0. 01%),可以作为饲料中牛、羊源性成分检测的常规方法。通过对15种市售饲料样品进行检验,结果 2种饲料骨粉未标明含有羊源性成分,但检出;1种饲料骨粉标签中未标明成分,但检出牛源性成分,证实该方法操作简便快捷,可以快速、准确、大批量地开展饲料的日常检测工作。     

蒙古绵羊肌内脂肪沉积相关基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

试验旨在建立一种适合于蒙古绵羊肌内脂肪沉积相关基因mRNA表达量的检测方法。根据GenBank中脂肪沉积相关基因的序列,分别设计1对特异性引物,然后通过克隆测序检测引物扩增片段的正确性,最后使用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术验证方法的可行性。结果显示,最佳的PCR反应参数为:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,40个循环;72 ℃延伸5 min。各目的基因的熔解曲线峰值单一,目的产物稳定。结果表明成功建立了一种快速检测蒙古绵羊肌内脂肪沉积基因的Real-time PCR方法,可用于绵羊肌内脂肪沉积基因的检测及定量分析。     

用四重PCR检测方法检测产单核细胞李斯特菌

为了同时快速准确的检测产单核细胞李斯特菌以及是否为有毒力的产单核细胞李斯特菌,根据相关文献报道的四重PCR方法,针对该菌的种特异性基因inl A基因进行引物设计,扩增片段大小为800bp,结果应用该PCR法可特异性的扩增出目的基因片段,与GenBank上发表的序列同源性为97.3%。同时通过对毒力基因inlB,inlC和inlJ的检测用来判断菌株的相关毒力。而同一属的其他菌种无害李斯特菌(L.innocua),韦氏李斯特菌(L.welshimeri)均无特异条带,嗜水气单胞菌(J-1),产气荚膜梭菌(C57-13),大肠埃希菌(ATCC 25922),鼠伤寒沙门菌(C79-32),金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)结果均为阴性。对临床上送检的23份样品进行四重PCR方法检测并同时与国家标准GB/T22429-2008食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速筛选检验中使用的检测方法进行比对,两种检测方法的结果完全符合,均检测出7份阳性样品。并且四重PCR法表明这7份阳性样品中的产单核细胞李斯特菌均携带有3种毒力因子(inlB,inlC和inlJ),因此该四重PCR法可用于快速鉴定是否是有毒力的产单核细胞李斯特菌,为有效预防控制产单核细胞李斯特菌污染提供技术支撑。     

绵羊痘病毒和山羊痘病毒双重PCR检测方法的建立及应用

为建立鉴别绵羊痘病毒(SPPV)和山羊痘病毒(GTPV)的检测方法,本研究针对这2种病毒的基因组序列,分别设计2对特异性引物,通过对引物浓度、退火温度等的优化,建立了快速鉴别检测SPPV和GTPV的双重PCR方法。该方法分别扩增出SPPV长度为177 bp和GTPV长度为222 bp的目的片段。特异性试验结果显示,该方法对牛疙瘩皮肤病病毒、犬细小病毒、大肠杆菌O157、沙门氏菌、健康羊组织和牛组织均无扩增。敏感性试验显示,该方法最低可检测1.725×107copies/μL的SPPV和1.71×106copies/μL的GTPV。应用该方法对50份临床病料样品进行检测的结果与病毒分离鉴定结果一致,均检出5份感染GTPV的病料和2份感染SPPV的病料,表明该方法可以用于临床病料样品的检测。     

牛瑟氏泰勒虫ITS基因PCR诊断方法的建立

本试验根据GenBank上登录的牛瑟氏泰勒虫ITS基因序列(AY661522.1),应用Primer Premier 5.0和Oligo 6.31软件设计合成1对特异性引物,以牛瑟氏泰勒虫DNA为模板,建立了牛瑟氏泰勒虫ITS基因PCR诊断方法。该方法扩增片段大小为1020 bp,与参考序列的同源性为98%;建立的PCR方法与猪附红细胞体、犬新孢子虫和弓形虫均无交叉反应,最低DNA检出量为1.5 pg/μL;通过对60份临床样品的检测,并与血涂片方法进行比较,结果显示PCR方法具有特异、敏感等特点,适用于牛瑟氏泰勒虫的检测。     

核酸水平检测犬副流感病毒方法的建立

根据GenBank中与犬副流感(CPIV)同源性较近的SV5病毒N基因保守序列,利用DNAStar软件设计了一对特异性引物,能扩增265bp大小的片段,并以此建立了检测CPIV的RT-PCR方法,实验证明该对引物特异扩增CPIV;不扩增犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒和狂犬病病毒犬的四种病原的核酸。检测临床病料20份,其中2分为CPIV阳性。此法敏感性较高。是检测犬急性传染性呼吸道疾病(CIRD)中CPIV的有效的方法。     

猪肌生成抑制素基因的克隆和序列测定

根据文献报道的猪肌生成抑制素基因cDNA序列，分别从第1、第2和第3外显子中设计引物，以大约克猪染色体DNA为模板，分段扩增出含内含子和外显子的序列。将所得各序列回收、克隆到pGEM-easyT载体中，然后进行序列测定。合并所有测得的猪肌生成抑制素因序列，共获得6kb连续序列。分析结果表明，猪肌生成抑制素基因第1内含子长1809bp，第2外显子长374bp，第2内含子长1978bp。所测得的外显子序列与已发表的cDNA序列同源分析比较，没有出现引起氨基酸改变的突变。表明瘦肉型猪（大约克猪）肌生成抑制素基因仍很完整，可通过改变基因结构等降低肌生成抑制素活性的方法提高瘦肉率。     

用探针杂交法检测鸡毒支原体和滑液囊支原体

根据鸡毒支原体(MG)和滑液囊支原体(MS)的16SrRNA基因序列，设计并合成了探针MG和MS共同目的基因，跨幅为580bP的一对引物。用这对引物对2个标准的MG和1个标准的Ms菌株DNA模板进行聚合酶锭反应(PcR)，结果得到了预期大小约580bP的PcR产物。回收纯化琼脂糖电泳凝肢中的MG扩增产物克隆至T载体中，DIG随机引物法合成核酸探针，斑点杂交试验对MG和MS均呈阳性，检测灵敏度分别为2ng和3ng，其它对照菌(毒)株为阴性。     

检测猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的二重PCR方法的建立

作者建立了一种同时检测猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的二重PCR方法。根据GenBank上发表的PPV和PRV基因序列,针对各自保守区各设1对特异性引物,用这2对引物对同一样品中的PPV和PRV进行检测,结果同时扩增出942 bp(PPV)和485 bp(PRV)2条特异性片段。特异性试验表明,对其他几种病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,该二重PCR能检出PPV 和PRV最低浓度分别为22、11.7 pg/L。该方法的建立对临床上进行这2种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。     

根据线粒体保守序列检测鹿属动物源性成分

本文根据鹿线粒体mtDNA细胞色素b中的保守序列 ,设计了针对鹿属动物的特异性扩增引物。通过聚合酶链反应 (PolymeraseChainReac tion,PCR)得到 1 94bp的特异片段 ,而其它动物如鸡、牛、羊、兔、猪、鱼、骆驼、马等中则无此条带。通过内切酶AlwI酶切可对扩增结果进行验证。该方法对鹿成分的检测低限为 0 1 % ,可作为饲料中鹿属动物源性成分鉴别检测的有效方法之一 ,也可作为鹿类药材真伪鉴别的方法。     

从疑似猪瘟病料中检出牛病毒性腹泻病毒

根据牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）ＮＡＤＬ株和猪瘟病毒（ＨＣＶ）Ａｌｆｏｒｔ株的核苷酸序列，设计合成了１对ＢＶＤＶ引物和３对ＨＣＶ引物。以从吉林、长春、哲盟３个地区经临床及病理学诊断为猪瘟的病料中提取的ＲＮＡ为模板，采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），分别以ＢＶＤＶ和ＨＣＶ引物进行扩增。结果，用ＢＶＤＶ引物从哲盟地区的疑似猪瘟病料中扩增出大小约４００ｂｐ的片段，而用３对ＨＣＶ引物在不同的条件下均未从该病料中扩增出相应大小的ＨＣＶ基因片段。此外，用ＨＣＶ的ＰＥ０／ＰＥ４引物从吉林、长春的病料中扩增出了ＨＣＶ的基因片段，但用ＢＶＤＶ引物从这两个地区的病料中均未扩增出ＢＶＤＶ的基因片段。从哲盟疑似猪瘟病料中扩增出的片段经克隆、序列测定及计算机分析证实，该片段的核苷酸序列和氨基酸序列与ＢＶＤＶ的同源性明显高于与ＨＣＶ的同源性。将哲盟病料接种于ＭＤＢＫ传代细胞，出现典型而规律的ＢＶＤＶ样细胞病变。由此证明，从哲盟疑似猪瘟病料中检测出的是ＢＶＤＶ而不是ＨＣＶ