实时荧光PCR和常规PCR方法检测饲料中鸡源性成分

根据鸡线粒体DNA序列,设计并筛选了鸡源性特异引物及探针,建立了饲料中鸡源性成分的常规PCR和实时荧光PCR检测方法,结果表明常规PCR方法最低可以从饲料中检出0.1%的鸡源性成分,实时荧光PCR方法最低可以从饲料中检出0.001%的鸡源性成分。该方法具有很高的特异性和灵敏性,可以作为鸡源性成分鉴别检测的常规方法。     

饲料中牛、羊源性成分现场可视化检测方法的建立

根据牛、羊线粒体中物种特异性序列设计引物,应用可视化环状等温扩增技术（visual loop-mediate isothermal amplification,vLAMP）对牛、羊源性成分进行快速扩增及可视化判断,同时建立牛、羊源成分人工污染的饲料模型,考察vLAMP检测方法的灵敏度。结果表明,牛源性引物和羊源性引物仅分别对牛、羊源性成分产生特异性扩增,灵敏度高达0.001%。本试验所建立的牛、羊源性成分现场可视化筛查方法具有较高的特异性与灵敏度,操作简单、快速,可用于饲料中牛、羊源性成分污染和食品掺伪的现场可视化检测。     

动物产品及饲料中牛源和羊源性成分PCR检测方法的优化

以牛肉、山羊肉为试验材料，对动物产品及饲料中牛源、羊源性成分PCR检测方法进行了优化。结果，牛源性成分的最低检测限可达10μg/g，羊源性成分的最低检测限达0．1μg/g。PCR检测和酶切鉴定结果表明，在水平测试的混合饲料粉中可检出牛源、羊源性成分。     

饲料中鱼源性成分定量检测的实时荧光PCR技术的建立

根据鱼线粒体DNA(mtDNA)基因组序列,选择高度保守区域设计特异性引物和TaqMan探针,通过反应条件优化,建立了饲料中鱼源性成分检测的实时荧光PCR方法.结果显示,应用该方法只能检测到鱼源性成分,表明该方法具有良好的特异性,对饲料中鱼源性成分的最低检出限为0.05%,定量检测的线性范围0.018～18.46ng.试验结果表明,该方法能对饲料中鱼源性成分进行准确、快速的检测,具有特异性好、灵敏度高的优点,对防止饲料掺假、控制进出口饲料安全具有重要意义.     

动物产品及饲料中牛源和羊源性成分三重荧光PCR检测方法的建立

为鉴定和区分饲料及动物产品中牛、山羊、绵羊源性成分,根据线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)种间保守序列,设计合成了3对特异性引物与TaqMan探针,通过对荧光PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了三重荧光PCR方法,在同一个荧光PCR反应中完成3种动物源性成分的检测。用该方法对16种不同源性的动物DNA进行检测,结果表明能特异地鉴别检测出牛、山羊和绵羊源性成分,且敏感性比现行国标PCR法高100倍。该方法适用于饲料、肉制品、奶制品等动物源性产品的检测。     

2种PCR方法检测饲料中牛和羊源性成分灵敏度

疯牛病自发生以来已给全球畜牧业带来了巨大的损失,已成为一种严重危害人类生命安全的传染病.因此,建立起有效的饲料中牛和羊源性成分的检测方法,避免带病毒的动物和饲料在市场上和国际间流通显得刻不容缓.目前,我国主要采用PCR方法进行饲料中牛和羊源性成分的检测.文章拟对普通PCR和Realtime PCR 2种方法的灵敏度进行比较,希望寻找出一种有效和灵敏度更高的方法,为实际的检测工作提供依据.     

实时荧光定量PCR检测畜禽肉制品中鸭源性成分

根据鸭mtDNA COX基因上的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR用于检测畜禽肉制品中的鸭源性成分。结果表明,建立的方法特异性强,与鹅、鸡、羊、牛等15种动物DNA无非特异性扩增;灵敏度高,可检测1.0pg/μL鸭源DNA的存在;重复性好,同DNA浓度所测得Ct值的变异系数均小于3%;应用该法对模拟混合样品进行检测,结果与预期相符,且常见肉类DNA的存在并不影响该法对鸭源性成分检测的灵敏度。说明本试验建立的鸭源性成分实时荧光定量PCR法特异、敏感、稳定,可快速准确检测畜禽肉制品中含有的鸭源性成分。     

鉴别牛羊布鲁菌实时荧光定量PCR方法的建立

[目的]建立准确、快速检测布鲁菌、羊种布鲁菌、牛种布鲁菌的方法。[方法]以BCSP31作为布鲁菌菌属特异性基因,以IS711插入元件作为布鲁菌菌种特异性标志,设计引物和Taqman探针;分别构建标准阳性质粒模板,将其10倍倍比稀释作多重实时荧光定量PCR标准曲线,评价多重实时荧光定量PCR反应体系的敏感性、特异性、重复性。[结果]建立了鉴别牛种、羊种布鲁菌的实时荧光定量PCR方法,并用该方法对临床样品进行检测。[结论]所建立的多重实时荧光定量PCR诊断方法能够快速、准确地鉴别牛种和羊种布鲁菌。     

进口饲料中牛源性与转基因成分的检测

本文介绍了进口饲料中牛源性与转基因成分的PCR检测方法。该方法用异硫氰酸胍提取进口饲料样品DNA,以牛特异性引物扩增模板DNA,扩增产物为271bp,PCR产物经限制性酶切片段分析,与预期设想一致;方法灵敏度实验结果显示,饲料样品中含有0.1%的牛源性成分时仍能检出。同时,根据转基因农作物最常使用的外源基因设计引物,在进口饲料中检测出35S启动子和NOS中止子等转基因成分,具有快速、简便、准确等特点。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测鉴定狮制品

为建立SYBR Green I实时荧光PCR检测鉴定狮（Panthera Leo）制品的方法,本文在豹属动物线粒体细胞色素b基因上设计狮特异性引物,建立并优化了SYBR Green I实时荧光PCR检测鉴定体系,采用17种血液、组织和骨粉类样品的DNA,通过扩增曲线和融解曲线分析检测的特异性和灵敏度,并用狮肉粉和牛肉骨粉系列百分比混合物进行抗干扰能力分析。结果显示,狮血液和组织DNA样品均出现特异性的实时扩增曲线,平均熔解温度在84±0.2℃。虎、豹、熊等14种哺乳动物DNA样本的检测结果均为阴性。灵敏度检测显示,本实验所建立的SYBRGreen I实时荧光PCR方法能够检测出10 pg/μL的狮组分DNA。抗干扰能力显示在骨粉中狮的成分最低检出含量为0.1%。这些结果说明,本文建立的SYBR Green I实时定量PCR方法具有方便、经济、灵敏度高和重复好等特性,可用于狮源性制品的检测鉴定。     

动物产品中牛、羊源性成分多重PCR检测方法的建立

以肉骨粉、鱼粉、猪肉干和鱼肉干为研究对象,异硫氰酸胍法提取总DNA,18S rDNA片段的扩增结果表明提取到的DNA中不存在抑制PCR的物质。应用梯度PCR技术对牛、羊源性成分检测的退火温度进行了优化,在单一PCR检测技术的基础上分别进行了18S rDNA片段和牛、羊源性成分的多重PCR分析,得到了预期的结果。试验表明,本文建立的多重PCR方法具有快速、简便、准确等特点,对动物产品牛、羊源性成分检测具有重要意义。     

荧光定量PCR法检测饲料中的牛、羊成分

疯牛病是一种严重威胁畜牧业发展和人类生命安全的传染病，因此对于我们国家而言，急需建立一套严格，规范的检验标准，防止疫区的牛，羊肉骨粉通过直接或间接贸易进口，本文运用荧光定量PCR法，针对牛，羊两种不同动物的特异性基因序列设计带有不同荧光标记的特异性探针，对整个PCR过程采用实时监控，最终通过不同的荧光信息来鉴定饲料中的牛，羊成分。本方法能有效解决普通PCR的样品污染问题，具有特异性强，灵敏度高，重复性好等特点。     

牛支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种快速检测牛支原体(Mycoplasma bovis)的实时荧光定量PCR检测方法。根据GenBank中收录的牛支原体OPPD/F基因序列(登录号:AF130119),利用Primer 5.0软件设计特异性引物与TaqMan探针,以重组质粒作为绝对定量模板,构建检测牛支原体的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。结果显示该检测方法线性关系良好,标准曲线的相关系数R2=0.994,扩增效率E=1.280。荧光定量PCR法检测的敏感性是常规PCR的10倍;特异性良好,检测9种相关细菌和病毒均为阴性;重复性好,组内及组间样本检测Ct值均小于2%。牛支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法较之于常规PCR方法有快速、特异性强、敏感性高、稳定性好的优点。     

饲料与动物产品中牛、羊源性成分的多重PCR检测

以鱼粉、奶粉、牛奶、果乳、鱼油及牛油为试验材料,进行了18S rDNA片段、牛源性成分和羊源性成分之间的多重PCR检测。多重PCR检测结果与单一PCR检测结果完全一致。结果表明,多重PCR方法用于进出口饲料及动物产品中牛、羊源性成分的同时检测是可行的。     

动物产品中猪源性和牛源性成分双重荧光PCR检测方法的建立

[目的]建立双重荧光PCR法,检测动物产品中猪、牛源性成分。[方法]分别针对猪、牛线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）种间保守基因,设计特异性引物与探针,通过对反应体系和反应条件的优化筛选,建立了双重荧光PCR方法,在同一个荧光PCR反应中完成2种动物源性成分的检测。并对该方法的特异性、敏感性进行评估。[结果]对16种不同的动物DNA进行检测．仅猪、牛源性成分收集到相应的典型的S型扩增曲线,对猪、牛二联模板的检测,可同时收集到相应模板的扩增曲线．其余14种动物源性成分未发现扩增曲线。双重荧光PCR对猪肉、牛肉模板的最低检出限均为10^-5,与相应的单重荧光PCR方法的检出限一致。[结论]该方法特异性强,敏感性高,适用于肉制品、奶制品、饲料等动物源性产品的检测。     

荧光PCR法定量检测动物源性饲料中的牛、羊成分

疯牛稿是由于健康牛食入含有致病性朊粗的人工蛋白质饲料(肉骨粉)所致，而目前尚未见能有效、快速地检测饲料中牛、羊成分的技术报道。本文在前期研究的基础上．运用荧光定量PCR法．针对牛、羊、鸡、猪几种不同动物的特异性基因序列设计了牛、羊两种动物的特异性探针，通过对整个PCR过程的实对荧光监测，来鉴定饲料中的牛、羊成分，并对其定量范围做了简单的计论。本方法能有效解决普通PCR的样品污染问题，具有特异性强、是敏度高、重复性好等特点。     

饲料及动物性食品中山羊源性和绵羊源性成分双重荧光PCR检测方法的建立

目的建立一种能同时检测饲料及动物性食品中的山羊和绵羊源性成分的双重荧光PCR方法,应用于动物源性饲料及动物性食品的快速检验.方法分别根据山羊、绵羊线粒体种间保守序列,设计合成针对山羊和绵羊的特异性引物及TaqMan探针,通过荧光PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立可同时检测饲料及动物性食品中的山羊和绵羊源性成分的双重荧光PCR方法.结果本研究所建立的双重荧光PCR检测方法可同时快速检测饲料及动物性食品中的山羊和绵羊源性成分,应用本方法检测山羊肉和绵羊肉模板的检出限均为10-5,与相应的单重荧光PCR方法的检出限一致,比国标法(GB/T20190-2006)的灵敏性高100倍.结论本研究建立的双重荧光PCR检测方法特异性好、敏感性强,适用于饲料、肉制品、乳制品等动物源性食品的快速检测     

双芽巴贝斯虫TaqMan实时荧光PCR检测方法的建立

根据双芽巴贝斯虫(Babesia bigemina)18SrRNA基因的保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,建立了检测双芽巴贝斯虫的实时荧光PCR方法。该方法灵敏度高,最小检出量为1.1×101 copies/μL的标准质粒,比常规PCR灵敏1 000倍;重复性好,组内和组间重复性试验的变异系数分别为0.21%¹.14%和0.31%1.14%和0.31%¹.50%,均小于2%;特异性强,对牛常见的其他两种血液原虫和健康血液无交叉反应。用建立的实时荧光PCR和常规PCR分别对30份临床样品进行检测,实时荧光PCR和常规PCR的检出率分别为30%和16.7%。结果表明,本研究建立的荧光TaqMan实时荧光PCR方法可以灵敏、准确、快速检测双芽巴贝斯虫感染,将为蜱传牛梨形虫病的流行病学调查和防制提供新的方法。     

应用多重Taqman-LNA荧光PCR同时检测肉制品中猪鸡鸭源性成分

为了建立同时检测肉制品中猪、鸡、鸭3种动物源性成分的多重Taqman-LNA荧光PCR,给打击肉制品掺假提供技术手段。针对动物线粒体基因组的保守序列,设计特异性引物和Taqman-LNA探针,建立同时检测肉制品中猪、鸡、鸭源性成分的多重荧光PCR方法,并应用于市售肉制品的检测。建立的多重Taqman-LNA荧光PCR方法可同时检测肉制品中上述动物源性成分,与牛、羊、驴、兔、鹅等动物源性成分无交叉反应,其检测限均达到肉含量的0.001%。对170份市售肉制品检测发现,有42份样品检出与标签标示成分不符的肉种成分,样品不合格率为24.7%。本研究建立的多重Taqman-LNA荧光PCR方法可同时检测肉制品中猪、鸡、鸭3种动物源性成分,具有特异、快速、经济、高效等优点,可适应于肉制品中多种肉源性成分的高通量检测。     

羊鞭虫病实时荧光PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测羊鞭虫病实时荧光PCR方法,根据GenBank已经公布的羊鞭虫(Trichuris ovis)ITS基因序列(登录号:JF680987.1),设计特异性引物和TaqMan探针,以重组质粒作为绝对定量模板,建立检测羊鞭虫病的TaqMan实时荧光PCR方法。对反应体系的特异性、敏感性和稳定性进行评价,并用该方法对临床样品进行检测。结果显示,该检测方法线性关系良好,标准曲线的相关系数R^2=0.994,扩增效率E=1.05。该方法特异性强,与其他8种常见家畜寄生性线虫病不发生交叉反应;灵敏度高,最低检出下限为31.7拷贝/μL;重复性好,组内和组间变异系数分别为0.43%~1.04%和1.20%~1.91%,均小于2.00%。用建立的实时荧光PCR方法和显微镜检查方法分别对20份临床样品进行检测,实时荧光PCR和显微镜检查方法检出的阳性样品分别为14和9份。本研究建立的TaqMan实时荧光PCR方法能在粪便中快速、准确、灵敏检测羊鞭虫卵,为羊鞭虫病的检测和防控提供新的方法。