甘蔗液泡膜二羧酸转运蛋白基因ScTDT克隆与表达分析

【目的】克隆甘蔗液泡膜二羧酸转运蛋白基因（ScTDT）,并分析其在甘蔗不同组织及在铝胁迫下的表达模式,为深入研究该基因功能及抵抗铝胁迫的分子机制提供理论依据。【方法】利用同源克隆技术从甘蔗品种ROC22中克隆ScTDT基因,利用生物信息学软件进行序列分析,采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在甘蔗不同组织（根、茎和叶）及在铝胁迫（0、10和20μmol/L Al3+）下的表达水平。【结果】克隆获得的ScTDT基因,开放阅读框（ORF）全长1623 bp,编码540个氨基酸残基,蛋白相对分子量57.34 kD,理论等电点（pI）5.77,为不稳定的疏水蛋白,可能定位于质膜、液泡和/或高尔基体,其氨基酸序列与高粱（XP_002460443.1）、水稻（XP_015612609.1）和玉米（PWZ04635.1）的TDT氨基酸序列具有高度相似性,其中与高粱的TDT氨基酸序列相似性最高,达96.30%,说明ScTDT与高粱TDT的亲缘关系最近。ScTDT基因在甘蔗根、茎和叶中均有表达,但根中表达量显著高于茎和叶（P< 0.05,下同）。在铝胁迫处理下,3个甘蔗品种（ROC22、柳城05-136和中糖1202）的根中ScTDT基因表达量较对照组（0μmol/L Al3+）均显著升高,尤其是柳城05-136和中糖1202随着营养液中Al3+浓度增加,ScTDT基因的表达量呈显著升高趋势,说明高浓度Al3+胁迫更能诱导ScTDT基因高效表达。3个甘蔗品种中,以中糖1202的ScTDT基因表达量变化最大,柳城05-136次之,以ROC22的变化最小。【结论】克隆获得的ScTDT基因表达具有组织特异性,在根中高效表达可能与甘蔗抵抗铝胁迫相关,即植株通过上调根中ScTDT基因表达,从而加快液泡中苹果酸的释放,促使苹果酸从根中分泌到土壤与Al3+反应,从而减少铝毒害,表明ScTDT基因可能参与甘蔗抵抗铝胁迫,且不同甘蔗品种的抗铝胁迫能力有所不同。     

铁盐处理下马铃薯NAC转录因子相对表达量时空差异分析

【目的】为明确马铃薯NAC转录因子在响应铁盐(Fe~(2+))胁迫时的表达特性,本试验对铁盐处理下马铃薯NAC转录因子相对表达量的时空差异进行分析。【方法】基于实验室前期对苗龄20 d的马铃薯品种东农312组培苗施加缺铁(1μmol/L)胁迫处理0、48 h,对其进行转录组测序,发现7个差异表达的NAC转录因子。本试验对MS培养基设置3个Fe~(2+)梯度(缺铁1μmol/L、对照100μmol/L和过量铁500μmol/L),分别用于处理组培条件下继代生长20 d的东农312脱毒试管苗,处理时间分别为0、48和96 h,应用qRT-PCR技术分析上述7个NAC转录因子在根、茎、叶中的相对表达量;并对NAC1～NAC7编码蛋白进行生物信息学分析。【结果】NAC1～NAC7在根、茎中均受缺铁、过量铁处理诱导表达,转录表达水平在处理48、96 h时较0 h时变化显著。在叶中,NAC1～NAC7在这两个时间点的表达量较0 h无显著上调。NAC1～NAC7编码蛋白含有192～413个氨基酸,均含有NAM结构域,预测分子量为22.81～46.98(kDa),PI值为4.65～9.23。【结论】马铃薯NAC转录因子参与响应铁盐胁迫。在缺铁和过量铁胁迫下,7个NAC基因在根和茎中均呈现显著差异表达,在叶中无显著上调表达。     

盐碱胁迫对转Lc-CDPK基因水稻抗氧化酶活性及基因表达的影响

【目的】研究盐碱胁迫对转羊草钙依赖蛋白激酶基因(Lc-CDPK)水稻根、叶片抗氧化酶活性及基因表达的影响。【方法】以转Lc-CDPK水稻为试验材料,通过qRT-PCR技术,测定根、叶片中Lc-CDPK基因的表达,确定该基因表达最高时的盐碱胁迫条件,以此条件处理幼苗,并以非转基因水稻为对照,分别测定其根、叶片中甜菜碱、脯氨酸、甘露醇、山梨醇、蔗糖等渗透调节物质含量和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等抗氧化酶活性及相关基因的表达。【结果】200 mmol/L NaCl-Na_2CO_3胁迫24 h时,转基因水稻根和叶片中Lc-CDPK基因表达的综合水平最高,此时转基因水稻和非转基因水稻(对照)的渗透调节物质含量和抗氧化酶活性有显著差异,转基因水稻根中脯氨酸、甘露醇和山梨醇含量分别较对照增加116.0%,88.9%和115.4%(P0.01),GR活性较对照提高9.6%(P0.05);叶片中脯氨酸含量较对照增加129.2%(P0.01),CAT、POD、GR和GPX活性分别较对照提高52.1%,27.5%,163.5%和46.7%。叶片中抗氧化酶基因相对表达显著增强,CAT、GPX基因相对表达量分别是对照的3.96和2.73倍(P0.01),根中仅GR基因相对表达增强,为对照的1.6倍(P0.01)。相关分析表明,根、叶片抗氧化酶活性与其基因相对表达量呈正相关。【结论】推测Lc-CDPK基因可能参与调控盐碱胁迫过程,能增强植株渗透调节物质的合成能力及抗氧化酶活性,提高水稻对盐碱胁迫的耐受性。     

柽柳cDNA文库的构建及ThAQP基因的表达

【目的】构建NaCl胁迫下柽柳根部cDNA文库,在盐胁迫下检测柽柳水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)基因的表达,探讨AQPs与柽柳耐盐性的关系。【方法】以0.4mol/LNaCl胁迫处理的刚毛柽柳(Tamarix hispida)根部组织为试材,分别构建未经盐胁迫及胁迫24,48h的cDNA文库,并测定文库滴度。对从文库中获得的EST序列进行拼接,获得刚毛柽柳AQP(ThAQP)的单一序列,对其进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR方法,研究ThAQP基因在盐胁迫后的刚毛柽柳根和叶中的表达情况。【结果】构建的NaCl胁迫0,24,48h3个文库的初始滴度分别为1.0×106,1.4×106和1.2×106pfu/mL,插入片段的平均长度分别为0.8,0.9和0.85kb,平均重组率为98.2%。文库克隆随机测序获得了刚毛柽柳的7条ThAQP基因单一序列,这7条ThAQP基因分别与水通道蛋白的4个亚家族成员基因具有很高的同源性。在根和叶中,这7条ThAQP基因表达对盐胁迫的响应不同,在根部ThAQP1～ThAQP4相对表达量增多,而其他基因的相对表达量变化不明显;在叶部,ThAQP7在胁迫24h时相对表达量出现小幅度上升,而其他6条ThAQP的相对表达量则明显下降。【结论】ThAQP基因可能与柽柳抵御盐胁迫有关。     

中国水仙ZDS反义基因表达载体的构建与转基因植株的获得

【目的】构建中国水仙ZDS反义基因表达载体,为进一步研究ZDS基因的功能、改良中国水仙花色、培育花色新品种提供参考。【方法】以中国水仙花为材料,采用RT-PCR方法克隆其ZDS基因,通过PCR、双酶切、连接等方法将ZDS基因反向互补插入到pCAMBIA1301双GUS植物表达载体中,构建ZDS反义基因表达载体P1301-ZDS,再通过冻融法将重组质粒P1301-ZDS导入根癌农杆菌。采用根癌农杆菌介导法将ZDS反义基因转化中国水仙带盘鳞茎,通过直接、间接、延迟筛选法3种方法对侵染的带盘鳞茎进行抗性筛选,采用直接筛选法和逐步降低选择压(质量浓度)方法对抗性鳞茎进行增殖和分化培养,采用GUS组织化学和hyg基因的PCR检测方法对中国水仙转基因植株进行鉴定。【结果】成功构建了中国水仙ZDS反义基因表达载体P1301-ZDS;延迟筛选法为根癌农杆菌侵染带盘鳞茎的有效筛选方法,转化效率达到28.54%;逐步降低选择压法为抗性小鳞茎增殖和分化培养的有效培养方法;将65株抗性小苗在1/2 MS+0.2mg/L NAA+10mg/L Hyg+100mg/L Cef生根培养基中培养,获得了12株再生植株,转化率达到18.46%;检测结果表明,10株抗性植株hyg基因和gus基因已经整合到中国水仙的基因组中并稳定表达;1株抗性植株稳定表达hyg基因但gus基因未稳定表达,1株抗性植株2个基因均未稳定表达。【结论】构建中国水仙ZDS反义基因表达载体并侵染中国水仙带盘鳞茎,经抗性筛选后获得12株中国水仙转基因植株。     

铝诱导玉米根系分泌异羟肟酸及对光照和铁素的响应

【目的】探究铝胁迫对玉米根系异羟肟酸分泌量和玉米植株异羟肟酸含量的影响及其相关性,分析铝胁迫下玉米根系异羟肟酸分泌对环境条件(光照和铁素)的响应,为进一步探明玉米耐铝机制提供理论依据。【方法】以泰玉11号(耐铝品种)和郑单958(铝敏感品种)为试验材料,采用水培法,设0μmol/L(对照)和20μmol/L AlCl₃处理,分别在3、6、9、12和24 h后,测定玉米根系异羟肟酸分泌量和玉米植株体内异羟肟酸含量,分析玉米根系异羟肟酸分泌量与植株体内异羟肟酸含量的相关性;设光照条件为自然光照(14 h光照/10 h黑暗)和黑暗(24 h),Fe³⁺浓度为0、5、10和20μmol/L,用0和10μmol/L AlCl₃处理24 h后,测定玉米根系异羟肟酸分泌量,分析铝胁迫下光照条件与铁素对玉米根系异羟肟酸分泌的影响。【结果】随着铝胁迫时间的延长,泰玉11号根系异羟肟酸分泌量呈增加趋势,铝胁迫9 h后,开始显著高于对照(P<0.05,下同);而在铝胁迫的各时间段,郑单958与对照均无显著差异(P>0.05,下同)...     

铝胁迫诱导八仙花根系分泌有机酸的研究

为揭示八仙花的耐铝机制,对铝胁迫下根系分泌的有机酸进行研究。以八仙花扦插苗为试材,研究其在铝胁迫条件下根系有机酸分泌种类、耐铝能力以及影响有机酸分泌的影响因子。结果表明,在铝胁迫下八仙花根系分泌草酸,当以50μmol·L-1Al Cl3处理八仙花时,根尖的铬天青染色明显,根尖伸长生长受阻显著,草酸分泌量也显著增加。铝处理后的最初4 h,草酸分泌量随铝胁迫时间的延长而增加,但在4~24 h内草酸分泌量并未增加。在铝溶液中加入阴离子通道抑制剂PG(10μmol·L-1和20μmol·L-1)和蛋白合成抑制剂CHM(25μmol·L-1和50μmol·L-1)后显著抑制根尖分泌草酸。说明八仙花根系分泌草酸是八仙花抵御铝毒的主要机制,而阴离子通道可能介导根系分泌有机酸。     

STK1基因对山梨醇高渗胁迫下玉米大斑病菌菌丝生长和发育的调控

【目的】明确STK1基因在山梨醇高渗胁迫条件下对玉米大斑病菌菌丝生长和发育的调控作用。【方法】将野生型菌株(WT)与STK1基因敲除突变体(KO)分别接种在不同山梨醇浓度的葡萄糖-蛋白胨(DPA)培养基上,对比其生长速度、菌落形态、菌丝形态的差异变化;并通过油红O染液进行菌丝细胞脂肪染色,观察脂类物质沉积的形态学变化。【结果】山梨醇高渗胁迫显著抑制了野生型菌株(WT)的菌落生长速度,但1.0 mol/L山梨醇对STK1基因敲除KO菌株的生长有显著的促进作用,这种促进作用随着山梨醇浓度的增加而迅速降低,山梨醇浓度增加至1.5~2.0mol/L时,菌落生长速度受到显著抑制,并且抑制程度显著高于WT菌株。显微观察菌丝细胞内容物,发现山梨醇高渗胁迫后,KO菌株的颗粒状物明显少于WT菌株。利用油红O染色观察菌丝细胞的脂类物质沉积情况,发现在山梨醇高渗胁迫条件下,KO菌株的脂滴数量远远少于WT菌株。【结论】山梨醇胁迫具有与盐胁迫不同的渗透调节机制,STK1基因可能通过调节脂类物质的合成及分布调控对山梨醇高渗透胁迫的调节。     

大豆rbcS基因启动子的克隆及在转基因烟草中的功能缺失分析

【目的】进一步验证栽培大豆rbcS基因启动子功能,为植物基因工程相关研究提供启动子资源。【方法】从栽培大豆中克隆了rbcS基因5′端上游1 538bp的DNA序列,根据光诱导表达调控元件及顺式作用功能元件所在的位置,设计含1 089,712和190bp 3个5′端缺失体,并将rbcS基因启动子(1 538bp)及3个5′端系列缺失体序列分别与gus基因融合,构建植物表达载体并命名为pGmrbcS、pA、pB和pC,用农杆菌介导法转化烟草,通过gus基因活性变化检测不同缺失体的表达特性。【结果】克隆了1 538bp的大豆rbcS基因启动子序列及1 089,712和190bp的5′端缺失体启动子片段。GUS活性检测表明,在pGmrbcS转基因烟草的叶中GUS活性最高,且与pCAMBIA1301转基因烟草叶片中CaMV35S启动子驱使gus基因的表达量相当,而茎、根中GUS活性较低。GUS定量分析表明,T1代转基因烟草光下培养时,3种缺失体启动子叶片中的GUS表达活性均与CaMV35S启动子相当,其中pB活性最高,是CaMV35S启动子活性的1.4倍,pA、pC活性低于pB,分别为pB活性的84%和71%;含pA的转基因烟草于黑暗中萌发的幼苗叶片gus基因不表达,光下萌发幼苗叶片有gus基因表达,而含有pB、pC的转基因烟草,在黑暗和光下萌发的幼苗叶片中均有gus基因表达,且表达量以pB最高。【结论】含有长度为1 089bp(pA)光诱导元件的rbcS基因缺失体启动子具有光诱导和组织特异表达特性,长度为712bp(pB)的缺失体启动子的启动活性最高。     

背部肌肉注射含IGF2b基因慢病毒载体对鲤鱼生长的影响

【目的】研究IGF2b基因对建鲤生长及体型的影响。【方法】用含有IGF2b基因的慢病毒载体注射建鲤背部肌肉组织,注射量分别为10,20和40μL/尾,阴性对照组不进行任何处理,阳性对照组注射20μL/尾去离子水。在相同饲养条件下饲养满9个月后,分别测量建鲤的各项生长指标。【结果】注射IGF2b基因的建鲤体质量、体长、体高、体厚、尾长均显著大于阴性对照组和阳性对照组,说明IGF2b基因在建鲤背部肌肉组织中过表达对鲤第2阶段生长同样具有促进作用,IGF2b基因在鲤背部肌肉组织中过表达对鲤的体型也有一定的作用。鲤的体长、体高、体厚的3D图也说明,随着IGF2b基因注射,鲤鱼倾向于具有更大的体长、体高、体厚的值。用多元逐步回归法做体质量的回归方程可知,鲤鱼的体质量与体长、体厚、尾长具有线性关系,利用体长、体厚、尾长这3个自变量进行聚类分析,即可准确得到鲤鱼5个注射组间的聚类关系:阴性对照组与阳性对照组共属一类,3个注射组同为一类,其中注射组中10μL注射组和20μL注射组为一类,40μL注射组为一类,IGF2b基因对鲤鱼体型的影响在注射量大于20μL/尾之后产生了转折,出现了负增长。【结论】IGF2b基因对鲤第2阶段生长同样具有促进作用,且对鲤鱼的体型有一定影响。     

沙门菌、巴氏杆菌和大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立

旨在建立一种可以应用于临床样本同时检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌感染的多重PCR方法。根据NCBI上已收录的沙门菌hut基因、多杀性巴氏杆菌 kmt1基因和大肠埃希菌23SrRNA基因的全基因序列,设计并合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能够同时检测3种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法可以从沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌以及3种细菌的混合物中扩增出3条大小分别为286 bp、457 bp和652 bp的特异性条带,其他对照组检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的最低检出量分别为1.77×10　、1.99×10　、2.01×10　 CFU/mL;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中检测出3种病原菌。可见：所建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的混合感染。     

细粒棘球蚴重组St-Eg 95-Eg.ferritin疫苗构建及生物学特性检测

构建表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的重组口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株并评价其生物学特性。将细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合基因插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,将重组质粒分别电转入减毒鼠伤寒沙门菌X3770和X4550,获得重组疫苗菌株St-Eg95-Eg.ferritin,对重组菌的稳定性、生长状态及安全性进行分析。结果表明,经PCR和酶切鉴定成功构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,Western blot检测Eg95-Eg.ferritin蛋白在重组菌中获得表达;生物学特性研究结果表明,重组质粒可稳定存在,且不影响重组菌的生长状态,小鼠口服试验证实,重组菌安全无毒性。成功构建能稳定表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株,将为研究包虫病口服基因工程疫苗奠定基础。     

四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1与ESBLs基因共转移分析

为了解四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况,及其与超广谱β-内酰胺酶基因(ESBLs)共存和共转移的特征,采用微量肉汤稀释法检测菌株对不同抗菌药物的敏感性;采用PCR检测菌株mcr-1,以及mcr-1阳性菌株中ESBLs基因类型;采用质粒接合转移试验分析了mcr-1与ESBLs基因共转移的耐药机制。结果显示:190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%,75.71% mcr-1阳性菌株中同时检出ESBLs基因,主要以blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因;mcr-1阳性菌对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01);质粒转移率为47.14%,其中获得mcr-1和ESBLs基因共转移的接合子表现出与供体菌相同的耐药表型及耐药基因。综上,在四川省食品动物源大肠杆菌中,mcr-1与ESBLs基因共存现象广泛存在,且耐药基因易发生水平传播,对菌株多重耐药性的产生具有重要意义。     

美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia的wsp基因分子检测及系统发育分析

【目的】对美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia进行分子生物学鉴定,确定该蓟马体内Wolbachia的进化位置,为进一步探讨Wolbachia对其生殖作用的调控机制提供理论依据。【方法】以wsp基因为目的基因,对美洲棘蓟马体内的共生菌Wolbachia进行特异性扩增和测序,使用Clustal X 1.83软件对所得DNA序列进行比对;在MEGA 4.0软件中采用邻接法对Wolbachia的系统发育关系进行分析。【结果】利用wsp基因的特异性引物从美洲棘蓟马体内扩增出了632 bp的Wolbachia的wsp基因片段(GenBank登录号为JN315668),580 bp的Wolbachia A群的wsp基因片段和405 bp的Mel亚群的wsp基因片段。系统发育分析结果表明,美洲棘蓟马体内的Wolbachia与黑腹果蝇亲缘关系较近。【结论】美洲棘蓟马体内感染的Wolbachia属于A群Mel亚群。     

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.     

兰州百合和有斑百合的核型研究

【目的】研究兰州百合及有斑百合的染色体核型。【方法】利用染色体常规压片的方法,对兰州百合和有斑百合的染色体数目及核型进行了研究和分析。【结果】兰州百合的核型公式为2n=2x=24=2m+2sm+6st+14t,相对长度为6.35%～12.07%,核型不对称系数为83.25%,染色体相对差异较大。有斑百合的核型公式为2n=2x=24=4m+12st+8t,相对长度为6.11%～12.90%,核型不对称系数为80.11%。【结论】兰州百合的核型类型属于3A型,有斑百合的核型类型为3B型,以有斑百合核型的进化较高,可见不同居群的百合间核型存在差异。     

Pina新等位变异Pina-D1o的分离及分析

Puroindoline基因(Pina和Pinb)是控制小麦籽粒硬度的主效基因,决定小麦加工品质,分离该基因的新等位变异有利于小麦籽粒硬度性状的改良。采用同源克隆方法从节节麦(Aegilops tauschii,DD PI603224)中分离到一个Pina新等位变异Pina-D1o。生物信息学分析表明,该基因编码区全长447bp,编码148个氨基酸残基,具有小麦族作物PinA蛋白所特有的WRWWKWWK色氨酸结构域和10个半胱氨酸所形成的5个二硫键结构。根据核苷酸序列构建的拓扑树,Pina-D1o与Pina-D1m、Pina-D1n相同,均由功能性等位变异Pina-D1a发生单基因突变而来,因而Pina-D1o有可能来源于Pina-D1a。可见,新等位变异类型PinaD1o的发现可以为小麦的籽粒硬度改良提供基因资源。     

苋菜AtrADH2基因克隆及表达分析

ADH基因在甜菜色素合成酪过程氨酸途径中发挥着重要作用,为探究苋菜酪氨酸途径的关键基因AtrADH2在苋菜中的功能,本研究以'苏苋1号'苏苋2号'苋菜品种为试验材料,利用RT-PCR技术等研究方法克隆获得1个AtrADH2基因(GenBank登录号:MT982371).结果表明:1)苋菜AtrADH2基因的ORF长为...     

日本白鲫BMP15和GDF9基因片段的克隆及组织表达分析

根据斑马鱼GDF9、BMP15基因的保守序列设计引物,采用RT PCR方法扩增获得日本白鲫GDF9、BMP15基因片段。日本白鲫GDF9基因片段长778 bp,编码145个氨基酸;BMP15基因片段长811 bp,编码270个氨基酸。氨基酸序列分析表明日本白鲫GDF9与斑马鱼的同源性最高,为78%,与其他物种的同源性在58%~78%之间;日本白鲫BMP15与斑马鱼同源性最高,为80%,与其他物种的同源性在30%~80%之间。系统进化树分析显示,鱼类的GDF9基因独立聚成一支,其中日本白鲫的GDF9基因与斑马鱼的GDF9基因聚成一支;鱼类的BMP15基因独立聚成一支,其中日本白鲫的BMP15基因与斑马鱼的BMP15基因聚成一支。半定量PCR结果显示,BMP15 mRNA在脾脏、肝脏、鳃、脑、心脏、肌肉、肾脏、卵巢中均有表达,其中卵巢中表达量最高;GDF9 mRNA在肝脏、脑、心脏、肌肉、卵巢中均有表达,而在脾脏、鳃、肾脏中表达量极低或不表达,在卵巢中表达量最高,为进一步研究日本白鲫GDF9与BMP15基因的结构与功能奠定了基础。     

甘蓝型油菜与黑芥双倍体减数分裂的原位杂交分析

【目的】探明植物杂种后代减数分裂异常与花粉败育之间的关系。【方法】通过甘蓝型油菜与黑芥种间杂交和基因组加倍,获得芸薹属三基因组双倍体,采用基因组原位杂交方法,观察三基因组双倍体花粉母细胞的减数分裂规律。【结果】与单倍体相比,双倍体花粉育性得到一定恢复,但可育花粉的比例较低,只有10%~20%。基因组原位杂交结果显示,双倍体花粉母细胞减数分裂终变期染色体以形成同源二价体为主,但也有部分染色体形成四价体或六价体。四价体有3种形式:B基因组染色体形成的四价体、AC基因组染色体形成的四价体及B与AC基因组之间形成的异配四价体。减数分裂后期Ⅰ染色体均等分离的细胞占总数的70%左右,在第2次减数分裂期也观察到非正常分裂如非四分孢子、微核等现象。【结论】减数分裂过程中的染色体异常行为可能是导致花粉育性不高的重要原因;虽然不正常的减数分裂导致花粉育性下降,但双亲染色体的异源联会可为双亲遗传物质的交换提供条件。