2010-2016年四川省食品动物源大肠杆菌的耐药性研究

【目的】了解2010-2016年四川省食品动物源大肠杆菌产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)情况及其耐药基因的变迁。【方法】以2010―2016年收集的444株食品动物源大肠杆菌(鸡源225株，猪源219株)为对象，采用纸片扩散法和微量肉汤稀释法分别检测其产ESBLs情况和药物敏感性；采用PCR测序法和脉冲场凝胶电泳(PFGE)检测携带ESBLs菌株的基因型特征和部分菌株的亲缘关系。【结果】444株大肠杆菌中，产ESBLs菌株的检出率为27.7%，其中鸡源菌和猪源菌检出率分别为42.2%和12.8%。2010-2016年产ESBLs菌株从16.9%升高至40.4%，鸡源菌株ESBLs检出率随时间变化比猪源菌更明显；ESBLs阳性菌株对大多数药物的耐药率显著高于阴性菌株，且多重耐药性问题更严重；产ESBLs菌株携带的耐药基因以bla_TEM和bla_CTX-M为主，并以bla_TEM-1(63.3%)、bla_TEM-52(32.1%)、bla_CTX-M-55(42.2%)、bla_CTX-M-65(27.8%)和bla_CTX-M-14(21.1%)为主要流行亚型，且检出率及ESBLs基因亚型复杂性呈逐年上升趋势；ESBLs阳性菌株有广泛PFGE谱型，即便携带相同基因型的菌株也不存在亲缘关系。【结论】四川食品动物源大肠杆菌产ESBLs菌株检出率及其耐药基因亚型的复杂程度呈逐年上升趋势，ESBLs是造成多重耐药性的主要原因，ESBLs耐药基因以水平传播为主。     

福建省猪源多黏菌素耐药基因mcr-1阳性细菌的耐药特性及分布特征

【目的】了解福建省猪源mcr-1基因阳性细菌的流行性、耐药特性及分布特征。【方法】从福建省7个地市的21个猪场采集313份粪便样本，应用PCR方法筛选、分离和鉴定mcr-1基因阳性细菌；采用K-B琼脂扩散试验进行药敏检测，分析mcr-1基因阳性细菌的耐药性，并使用PCR方法分析其耐药表型；进一步采用多位点序列分型（MLST）方法鉴定mcr-1基因阳性大肠杆菌的类型，使用脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析方法对mcr-1阳性大肠杆菌进行聚类分析，探明其分布特征和亲缘关系。【结果】从313份猪粪便中共分离获得43株mcr-1基因阳性细菌，其中大肠杆菌39株。耐药性结果显示，分离菌株对磺胺甲基异恶唑、氟苯尼考、链霉素、强力霉素、恩诺沙星、新霉素、阿莫西林、头孢噻肟、林可-壮观、亚胺培南、呋喃妥因、利奈唑胺和替加环素的耐药率分别为90.1%，83.7%，74.4%，67.4%，67.4%，58.1%，53.5%，39.5%，34.9%，11.6%，4.6%，0和0。磺胺类耐药基因中的sul1、sul2和sul3基因检出率较高，分别达到81.4%，90.7%和74.4%；喹诺酮类耐药基因中仅有qnrS和aac(6′)-Ib-cr被检出，其检出率分别为51.2%和30.2%；氯霉素类耐药基因中Cat2和cmlA基因的检出率较高，分别达到86.0%和74.4%；氟苯尼考耐药基因（floR）的检出率为83.7%；金属β-内酰胺酶耐药基因（NDM-1）的检出率为23.2%；多药耐药基因（cfr）的检出率为7.0%；而替加环素耐药基因（tet(X)）未被检出。39株mcr-1基因阳性大肠杆菌除了4株不能分型外，其他35株共分为19个ST型，具有高度多样性，其中ST10为优势型，共有9株菌株。PFGE图谱显示，39株mcr-1基因阳性大肠杆菌共获得30种PFGE谱型，具有多态性特征，分为6组克隆群。【结论】福建猪源mcr-1基因阳性细菌主要为大肠杆菌，少部分为肠杆菌科其他菌株，且分离菌株具有明显的多重耐药性；mcr-1基因阳性大肠杆菌在地域分布上具有多态性和高度多样性特点。     

猪源大肠埃希菌中质粒介导喹诺酮耐药（PMQR）基因的多样性研究

为研究陕西省关中猪源大肠埃希菌的耐药情况及质粒介导的喹诺酮耐药（PMQR）基因的流行性与多样性,于2017年4月-2018年11月从陕西关中地区数个养猪场分离获得470株大肠埃希菌,采用微量肉汤稀释法测定其对包括3 种氟喹诺酮类药物在内的6类抗菌药物的最小抑菌浓度（MIC）,PCR扩增检测其携带的PMQR基因,并分析PMQR基因阳性菌株gyrA和parC基因的质粒介导喹诺酮耐药决定区（QRDR）的突变情况。结果显示,陕西猪源大肠埃希菌对阿莫西林和土霉素的耐药率高达100%和98.51%,对阿米卡星、氟苯尼考、替米考星和头孢噻呋的耐药率分别为60.64%、52.98%、50.85%和44.47%,且  89.58%为多重耐药菌株。对3种氟喹诺酮类药物恩诺沙星、普多沙星和环丙沙星的耐药率分别为89.58%、  57.66%和56.80%。对美罗培南最为敏感,未发现耐药菌株,但有9株大肠埃希菌对美罗培南的敏感性为中介。对氟喹诺酮类药物耐药的菌株中,PMQR基因qnrS、 aac(6′)-Ib-cr、qnrB、qnrA、qnrD和 qepA的检出率分别为  36.52%、30.14%、17.38%、11.45%和2.49%,且55.30%的菌株携带1种PMQR基因,37.90%携带2种PMQR基因,6.40%携带3种PMQR基因,0.35%携带4种PMQR基因。在282株携带PMQR基因的菌株中,279株发生QRDR突变,其中以gyrA基因的Ser83Leu突变为主。132株PMQR基因阳性菌株parC基因发生Ser80Ile或Ser80Ile+Glu84Val突变。随着菌株所携带PMQR基因的增多,gyrA和parC基因的突变位点也相应增加,细菌的耐药水平也随之增加。     

乌鲁木齐市售畜禽肉源大肠杆菌的耐药性分析

【目的】调查新疆乌鲁木齐市售畜禽肉中大肠杆菌的耐药性及其所携带的耐药基因情况,为肉类食品的耐药性监测及防控提供依据。【方法】从乌鲁木齐市7区19家超市采集畜禽肉样品353份,其中鸡肉90份、猪肉90份、牛肉84份、羊肉89份,对采集的肉类样品进行大肠杆菌的分离与鉴定。用麦康凯琼脂培养基和科玛嘉尿道菌群定位显色培养基对菌株进行初步筛选分离,用特异性16S rDNA法鉴定大肠杆菌。通过PCR对分离菌株进行系统发育分群,采用K B纸片琼脂扩散法测定分离菌株的耐药表型,PCR扩增法获得相应的耐药基因并测序。【结果】从乌鲁木齐市353份市售畜禽肉样中分离鉴定得到大肠杆菌252株。系统发育分群结果显示,分离的252株大肠杆菌菌株以A群（79.4%）为主,其次是B1群（12.3%）。耐药表型测定结果表明,大肠杆菌对四环素（49.6%）、氨苄西林（41.6%）、复方新诺明（30.9%）和氯霉素(26.6%)的耐药率较高;而对阿米卡星（1.9%）、多粘菌素B（0.8%）和氨苄西林-舒巴坦（0.4%）的耐药率较低。耐药基因tetA、bla_TEM、cml1、aadA1、aac、sul1和bla_CTX-M的检出率分别为90.4%,32.1%,31.3%,27.4%,14.5%,12.8%和9.2%,未检出tetE、tetG和bla_SHV基因。【结论】乌鲁木齐市售畜禽肉存在严重的大肠杆菌污染问题,畜禽肉作为多重耐药菌的“储存库”,在细菌耐药性的播散中发挥重要作用,应加以重视。     

源自合肥地区表观健康鸡的沙门氏菌耐药性与血清型、 基因型相关性分析

为了解源自合肥地区表观健康鸡的沙门氏菌耐药性及其与血清型、基因型的相关性,在前期已鉴定血清型和ERIC基因型的基础上,采用K-B纸片法对21株沙门氏菌分离株进行21种抗生素药物敏感试验,利用PCR技术对耐药菌株进行32种耐药基因检测。结果显示,总耐药率为100%（21/21）,耐2种以上抗生素的菌株占76.19%（16/21）,多重耐药谱为青霉素-氨苄西林-阿莫西林-链霉素-复方新诺明,其中耐受β-内酰胺类抗生素的类别最多,耐药率最高达100%（21/21）。21株沙门氏菌均检出耐药基因,涉及bla_PSE、sul1、strA、bla_TEM、sul2、tetA、tetB、aph3-Ⅱa和catⅠ 9种,其中bla_PSE基因的检出率最高,为85.7%（8/21）。可见源自合肥地区表观健康鸡的沙门氏菌对β-内酰胺类抗生素耐药性最强,与其携带bla_PSE基因有关;耐药表型测定结果与耐药基因检测结果基本一致;耐药性与具有相同来源的同一血清型、基因型相关。     

油菜菌核病菌激发子基因SsXYN克隆及表达载体构建

以核盘菌菌株NGA₄提取的总RNA为模版,利用RT-PCR技术扩增获得SsXYN基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD19-T载体上,菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了核盘菌SsXYN基因。从pMD19-T : SsXYN载体上,用BamH I和Sal I 双酶切切下目的基因片段,将该基因片段连接到原核表达载体pET32a中。菌落PCR和酶切鉴定结果显示成功构建了表达载体pET32a : SsXYN。利用热击法将该重组表达载体导入大肠杆菌BL21,获得携带SsXYN基因的大肠杆菌菌株,为进一步研究激发子诱发植物抗病性机理奠定了基础。     

黄曲霉ste20-like基因功能鉴定及与ste20基因功能的比较

为了鉴定ste20-like基因在黄曲霉生长、分生孢子形成、菌核形成中的作用以及其侵染性,并比较其与ste20基因功能的差异,以A.flavus NRRL3357为研究对象,对两个基因进行相似度比对和生物信息学分析,根据同源重组策略获得单基因缺失菌株Δste20、Δste20-like和双基因缺失菌株Δdouble（Δste20-like&ste20）,并分析基因敲除对菌株生长、分生孢子形成、菌核形成、黄曲霉毒素B₁（AFB₁）生物合成和侵染功能的影响。应用pyrG的双向遗传筛选成功获得Δste20、Δste20-like和Δdouble;与野生型相比,单基因缺失和双基因缺失突变株的生长速率、分生孢子量、菌核数量以及侵染能力都显著降低,在毒素合成方面,Δste20、Δste20-like和Δdouble菌株分别降低约76%、93%和72%;突变株之间比较发现,ste20-like缺失对生长速率的影响大于ste20基因;突变株之间的分生孢子产生量无显著差异;Δste20无菌核产生而Δste20-like还有少量菌核产生;Δste20-like菌株产生的毒素显著低于Δste20和Δdouble菌株。ste20-like基因正调控黄曲霉生长、分生孢子生成、菌核形成、AFB₁生物合成,并影响黄曲霉分生孢子对粮油种子的侵染能力。与ste20基因功能相比,ste20-like基因在调控黄曲霉生长、毒素合成方面对菌株的影响方面较显著,而在菌核形成方面ste20的基因调控作用更显著。     

马铃薯转录因子StNAC043基因的克隆及其生理功能分析

为探究马铃薯转录因子StNAC043基因的功能，克隆马铃薯转录因子StNAC043基因，利用农杆菌介导法将其转入马铃薯‘东农310’基因组，使其过量表达。转基因植株经无性系扩繁后，测定转基因株系的根和茎的生长指标、叶绿素相对含量(SPAD)以及荧光参数(F_v/F_m、ETR_max)，并以转录组测序结合qRT-PCR验证分析其下游调控基因。结果表明:StNAC043基因过量表达可以显著促进转基因马铃薯根系和茎的生长、显著提高转基因植株叶片SPAD、F_v/F_m、ETR_max；并且转录因子StNAC043可以调控捕光色素结合蛋白基因StCAB1和StCAB2的表达。综上，马铃薯转录因子StNAC043基因对马铃薯幼苗的生长和光合生理调控具有重要作用。     

副溶血性弧菌vtrB基因敲除菌株的构建及其在抵抗胆汁中的作用

构建副溶血性弧菌转录调节因子VtrB （V.parahaemolyticus T3SS2 regulator B）敲除菌株和回补菌株,探讨VtrB在副溶血性弧菌抵抗胆汁中的作用。根据GenBank数据库中副溶血性弧菌vtrB基因上下游序列设计引物,通过融合PCR将vtrB基因上下游同源臂融合并克隆入自杀质粒pDS132中,将重组自杀质粒转入大肠杆菌S17-1 λpir中,再接合转移至副溶血性弧菌中进行同源重组,通过10%蔗糖筛选获得vtrB基因突变株ΔvtrB。将pBAD33-vtrB重组质粒电转入ΔvtrB突变株中获得回补菌株C-ΔvtrB。研究副溶血性弧菌野生型、突变株和回补株在2%脱氧胆酸盐（DOC）处理后的存活率。基于同源重组原理,经vtrB基因的PCR扩增和转录水平检测结果表明,成功获得副溶血性弧菌vtrB基因缺失突变株ΔvtrB和回补株C-ΔvtrB。与野生型和回补菌株C-ΔvtrB相比,ΔvtrB突变株在2% DOC处理20、40和60 min后的存活率分别为17%、4%和1%,vtrB基因的失活使得副溶血性弧菌对胆汁抵抗能力极显著降低（P<0.001）,表现出存活能力的缺陷。由此表明,转录调节因子VtrB有助于副溶血性弧菌对胆汁的抵抗。     

金鱼Tgf2转座酶的原核表达及其DNA结合活性

金鱼Tgf2转座子基因属于Hobo/Activator/Tam3（hAT）超家族,其编码的活性转座酶能在多种鱼类转座中介导基因插入及诱变,因此在鱼类重要性状主控基因的筛选、功能解释及育种等方面具有重要的应用前景。鉴于Tgf2转座酶基因（JN886591）存在众多稀有密码子,本研究依据大肠杆菌对密码子的偏好性,对金鱼Tgf2转座酶基因进行密码子优化,所得Tgf2转座酶基因连接原核表达载体pET-28a（+）,将重组载体转化到大肠杆菌BL21（DE3）细胞。该大肠杆菌细胞在培养温度37℃、OD₆₀₀≈0.5时用IPTG诱导获得高效表达,即菌体中含有8.8%的重组蛋白,上清液中含有4.0%重组蛋白。采用亲和层析纯化从菌体上清液中分离得到分子量约70 ku的可溶性重组蛋白,经MALDI-（TOF）/TOF串联质谱鉴定其为重组Tgf2转座酶。进而采用分子排阻色谱法研究转座酶的DNA结合活性,结果表明：所得重组Tgf2转座酶能识别并结合含Tgf2转座子特异性亚末端重复序列的DNA探针,即启动转座。采用原核表达体系高效获得重组Tgf2转座酶,为其作为工具酶应用于鱼类生物学研究奠定必要的基础。     

宠物源大肠埃希菌耐药性及耐药基因调查

【目的】了解广州市宠物源大肠埃希菌Escherichia coli耐药性和耐药基因携带情况。【方法】2016年7月至2017年7月从广州市4家宠物医院采集健康或患病犬猫样品共319份,其中,健康动物127份,患病动物192份。采用选择性培养基分离大肠埃希菌,利用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)鉴定菌种;采用琼脂稀释法测定大肠埃希菌对11种抗菌药物的敏感性,利用PCR和测序检测耐药基因的携带情况。【结果】319份样品共分离得到大肠埃希菌203株,其中,患病动物源109株,健康动物源94株。203株大肠埃希菌中有179株至少对1种抗生素耐药;对氨苄西林耐药率最高(76.85%),对头孢噻肟、四环素、多西环素和磺胺甲噁唑-甲氧苄啶耐药率均高于50%;对阿米卡星最为敏感,耐药率仅为10.84%。患病动物源大肠埃希菌对11种抗菌药物的耐药率均高于健康动物源,除阿米卡星、氟苯尼考和磷霉素外,对其他药物的耐药性均差异极显著(P 0. 01)。耐药基因检测结果显示,floR检出率最高(检出率为34.97%),blaCTX-M-9G、blaCTX-M-1G、fos A3、rmt B和bla CMY-2检出率分别为22.66%、20.19%、17.73%、10.34%和1.48%,未检测到blaCTX-M-2G和blaCTX-M-25G。【结论】广州地区宠物源大肠埃希菌耐药状况严峻,且常携带多种重要耐药基因。应当加强对宠物源细菌耐药性的监测。     

2015—2017年新疆动物源鼠伤寒沙门菌耐药性分析

为完善新疆动物源鼠伤寒沙门菌耐药的相关数据,为多重耐药病源菌的防控提供依据,本研究检测了2015—2017年新疆不同动物源鼠伤寒沙门菌的流行情况、耐药特性及耐药基因携带率。对经选择性培养基和特异性PCR鉴定的不同动物源鼠伤寒沙门菌,通过琼脂稀释法进行环丙沙星等12种抗菌药物的最小抑菌浓度测定,同时采用PCR方法测定耐药基因在鼠伤寒沙门菌中的携带情况。结果表明:从不同动物中共分离获得162株鼠伤寒沙门菌,分离率由高到低依次为宠物(犬和猫)、猪、羊、牛和鸡;药敏试验显示,不同动物源鼠伤寒沙门菌对环丙沙星、氨苄西林、四环素和氟苯尼考的耐药率80.0%,未检出对阿米卡星和磷霉素耐药的耐药菌株。从不同动物源分离的162株鼠伤寒沙门菌中有159株菌为多重耐药菌株,占98.1%;不同动物源鼠伤寒沙门菌多重耐药均以CIP-AMP-TET-FFC-SMZ 5耐谱型为主。经耐药基因分析,不同动物源鼠伤寒沙门菌耐药基因检出率为6.8%～97.4%,未检出blaSHV、qnrD、rmtB和mcr-1基因。综上,鼠伤寒沙门菌在新疆不同动物中流行率高,耐药现象严重,多重耐药菌株较多且耐药基因携带率高,部分不同动物源菌株间具有相同的耐药表型和耐药基因型。应加强畜牧业抗菌药物使用的管理制度,进而控制鼠伤寒沙门菌耐药性的发展趋势。     

Characterization of blaCTX-M Gene in One Klebsiella pneumoniae Isolate from Sick Chickens in China

Two Klebsiella pneumoniae isolates (Kpc1 and Kpc2) were obtained from liver samples of seven dead chickens and identified with Vitek-32 automated identification system. Antimicrobial susceptibilities were determined by the microdilution broth method. Detection of genes encoding class A β-lactamases was performed by PCR amplification, and cloning of the ESBL gene was by plasmid restriction and fragments ligation. Conjugation assay, transformation experiments and plasmid profile analysis were performed. The incompatibility group of ESBL-carrying plasmid was determined by the PCR-based replicon typing method. Lastly, the genetic environment was analysed by direct sequencing of the DNA surrounding the ESBL gene. The genes associated with tetracycline and gentamicin resistance were also sought by PCR. The results revealed that the ESBL phenotype-negative strain Kpc2 only showed resistance to ampicillin, amoxicillin, tetracycline, and doxycycline and carried bla_TEM-1 and tet(A) genes. The ESBL-producing strain Kpc1 exhibited multidrug resistant phenotype and harbored bla_TEM-1, bla_CTX-M-14, tet(A), tet(B), and rmtB genes. K. pneumoniae Kpc1 contained four plasmids with molecular sizes of approximately 59, 6.9, 2.8, and 1.6 kb, but only a 59-kb plasmid, carried bla_TEM-1 and bla_CTX-M-14 genes, was observed in its transconjugant. The incompatibility group of plasmid carrying bla_CTX-M-14 gene could not be determined. The bla_CTX-M-14 gene was flanked upstream by an ISEcp1 insertion sequence and downstream by an IS903 element. This work shows that CTX-M-14 is present in K. pneumoniae isolates from chickens in China. The bla_CTX-M-14 gene was associated with an upstream ISEcp1 insertion sequence. Our results underline the need for continuous surveillance of the prevalence and evolution of this CTX-M-type β-lactamase in China.     

虾源副溶血弧菌致病基因检测与ERIC-PCR分型

为了监测上海市养殖对虾中副溶血弧菌致病基因的携带情况及潜在致病株流行情况,采用PCR方法对上海地区不同对虾养殖单位中分离获得的19株副溶血弧菌分离株及1株标准菌株进行6种致病基因的检测筛查,并采用ERIC-PCR方法进行基因分型分析。结果发现:19株副溶血弧菌中未检测出携带tdh、ORF8基因,只有1株携带trh基因,而tox RS/new基因携带率较高,19株中有14株检出阳性,基因携带率为73.7%。对能够引起对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的副溶血弧菌特异性质粒基因的检测中发现,AP1和AP2基因均有3株检测出阳性,基因携带率均为15.8%。通过ERIC-PCR分型技术将20株副溶血弧菌分成7个不同的类群,其分辨力指数DI值为0.811,表明ERIC-PCR具有较好的基因分型能力,分型结果发现该方法能够有效区分不同时间段获得的菌株,而对不同地理位置获得的菌株区分并不明显。以上结果表明从养殖对虾中分离得到的副溶血弧菌致病基因携带率总体偏低,但存在一定的流行风险,需要防范一些新的致病株的流行,这些可以为对虾养殖单位中副溶血弧菌致病流行株的预防控制提供相关参考。     

鸡源致病性大肠杆菌对四环素类抗生素耐药性及耐药基因检测

为更好地了解鸡源致病性大肠杆菌对四环素类抗生素的耐药性及耐药基因分布,从陕西省部分规模化养鸡场的病、死鸡中经分离鉴定得到158株致病性大肠杆菌。采用K-B药敏纸片法检测致病性大肠杆菌分离株对4种四环素类药物的药敏性,PCR方法检测3种四环素类耐药基因,用DNAStar软件对获得的耐药基因序列与GenBank中的相关序列进行比对。结果显示,鸡源致病性E.coli分离株对四环素、金霉素、土霉素以及多西环素的耐药率分别为88.6%、77.2%、87.3%、50.6%,3重以上耐药菌株占78.5%。四环素类耐药基因tetA、tetB的检出率分别为81.4%、20.7%,未检测到tetC基因。结果表明,鸡源致病性E.coli对四环素类抗生素普遍具有耐药性,且以多重耐药为主;耐药基因tetA的检出率与其耐药性呈正相关。     

Molecular Mapping of Two Novel Stripe Rust Resistant Genes YrTp1 and YrTp2 in A-3 Derived from Triticum aestivum × Thinopyrum ponticum

Loss of variety resistance to stripe rust (Puccinia striiformis Westend f. sp.tritici) is an important factor causing massive periodical epidemic of rust in wheat production. Creation and development of new races of rust pathogen have led to serious crisis of resistance loss in widely planted varieties. This has quickened the search for new resistance resources. Molecular marker could facilitate the identification of the location of novel genes. A line A-3 with high resistance (immune) to currently epidemic yellow rust races (CY29, 31, 32) was screened out in offspring of Triticum aestivum × Thinopyrum ponticum. Segregation in F₂ and BC₁ populations indicated that the resistance was controlled by two independent genes: one dominant and one recessive. SSR markers were employed to map the two resistant genes in the F₂ and BC₁ populations. A marker WMC477-_167bp located on 2BS was linked to the dominant gene with genetic distance of 0.4 cM. Another marker WMC364-_{208 bp} located on 7BS was linked to the recessive-resistant gene with genetic distance of 5.8 cM. The two genes identified in this paper might be two novel stripe rust resistant genes, which were temporarily designated as YrTp1 and YrTp2, respectively. The tightly linking markers facilitate transfer of the two resistant genes into the new varieties to control epidemic of yellow rust.     

棉铃虫细胞色素P450家族 CYP6AE14 基因克隆、序列分析及蛋白原核表达

采用同源克隆技术克隆石河子棉区棉铃虫抗性品系的P450家族解棉酚基因 CYP6AE14 。克隆获得的目的基因全长1 581 bp,编码526个氨基酸。序列分析表明,该抗性品系的 CYP6AE14 有1个氨基酸发生突变,即Y25F;其与烟草天蛾的CYP6AE32同源性较高,达60%。利用原核表达载体pET28 a在大肠杆菌中成功表达棉铃虫P450 CYP6AE14 基因,为进一步的基因功能验证奠定基础。     

安徽3株柔嫩艾美耳球虫cox1基因部分序列的比对分析

为研究柔嫩艾美耳球虫不同地理株的线粒体细胞色素c氧化酶第1亚基(cox1)基因与球虫种群之间的遗传关系,以安徽3个地区的3株柔嫩艾美耳球虫为研究对象,通过卵囊的分离与纯化获得纯种虫株,然后应用PCR技术对柔嫩艾美球虫3个地理株的cox1序列进行扩增,并与GenBank上登录的鸡柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫和堆形艾美耳球虫虫株的相应序列进行比对分析。结果显示,每个虫株都成功扩增出800 bp左右的cox1部分有效序列(pcox1),与柔嫩艾美耳球虫pcox1序列种内无差异,pcox1相应序列种间的差异程度为9.9%～14.9%。表明柔嫩艾美耳球虫的cox1序列可作为艾美耳球虫种间遗传变异研究的标记,为进一步研究艾美耳球虫的群体遗传学特性和耐药性奠定了基础。     

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.     

基于比较转录组学分析揭示中华蜜蜂及意大利蜜蜂幼虫的球囊菌抗性差异机制

为探究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,以下简称中蜂)与意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,以下简称意蜂)幼虫的球囊菌(Ascospahaera apis)抗性差异产生的原因,利用Venn分析、GO分类分析、KEGG代谢通路分析以及Ka/Ks分析对二者的转录组进行比较研究。Venn分析结果显示,中蜂与意蜂的同源基因有17 656个,归属于8 111个基因家族,二者的特有基因分别有1 158和241个,分别归属于468和86个基因家族。GO分类结果显示,中蜂和意蜂的特有基因分别富集在38和28个GO条目。KEGG代谢通路富集分析结果显示,中蜂和意蜂的特有基因分别富集于96和21个代谢通路;进一步分析发现中蜂的特有基因富集在内吞作用、溶酶体、泛素介导的蛋白水解和黑化作用等4个细胞免疫通路,以及MAPK信号通路和Toll-like受体信号通路等2个体液免疫通路,而意蜂仅有1个特有基因富集在MAPK信号通路。Ka/Ks分析结果显示受到强烈正向选择、弱正向选择、中性选择和负向选择的单拷贝同源基因分别有37、281、2 630和3 269个。对受到强烈正向选择的基因进行GO分类和KEGG代谢通路富集分析,GO结果显示中蜂和意蜂的单拷贝同源基因富集的GO条目类型相同;KEGG结果显示中蜂的单拷贝基因仅富集在氧化磷酸化。上述结果表明免疫相关基因数量的差异是二者的球囊菌抗性差异产生的重要原因之一,中蜂在与球囊菌的协同进化过程中可能通过提高能量利用从而限制球囊菌的增殖。本研究结果可为阐明中蜂及意蜂幼虫的球囊菌抗性差异产生的分子机制提供参考。