转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。     

海南50个甘蔗品种黄叶病毒的分子鉴定

为明确国家甘蔗体系集成示范及区试甘蔗品种在海南省被甘蔗黄叶病毒(SCYLV)侵染情况及病毒基因型类型,从集成示范及区试的50个甘蔗品种上采集带有显著病症或不显病症样品50份,采用特异引物通过RT-PCR方法进行甘蔗黄叶病毒检测和病毒基因型鉴定。结果表明:50个甘蔗品种中有31个被检测到SCYLV,检出率为62%;病毒基因型有古巴(CUP)基因型、巴西-秘鲁(BAR-PER)基因型和留尼汪岛(REU)基因型3种,主要以CUP基因型为主,占58.06%,其次是BAR-PER基因型,占51.61%,REU基因型最少,占29.03%;未发现CHN1、CHN2、CHN3基因型。另外,不同基因型混合侵染现象普遍存在,总混合侵染率达32.26%。可见,海南国家甘蔗体系集成示范及区试甘蔗品种严重感染甘蔗黄叶病毒(SCYLV),且存在不同基因型混合侵染,建议推广种植脱毒种苗来控制甘蔗黄叶病的发生。本研究为在海南蔗区推广和种植甘蔗脱毒种苗及抗病育种提供了理论支持。      

转基因甘蔗红糖DNA的提取及分子鉴定

随着不同转基因生物(GMO)制品的不断商业化,转基因成分检测技术也需不断更新。由于甘蔗红糖为甘蔗汁经高温熬煮浓缩而成,红糖中残留的DNA降解严重、含量低、片段短,且蛋白及糖分杂质含量高,所以甘蔗红糖DNA是比较难以收集并进行分子检测的。为了在转基因甘蔗红糖商业化前建立起转基因甘蔗红糖DNA的提取及分子鉴定技术,本研究以转基因甘蔗和非转基因甘蔗为材料,模仿传统的红糖制作工艺,分别获得了转基因甘蔗红糖与非转基因甘蔗红糖。通过对DNA提取方法进行改进,设计不同扩增片段长度的引物,并对传统PCR与荧光定量PCR进行比较,建立了稳定的甘蔗红糖DNA的提取方法及外源基因分子鉴定技术该技术对转基因甘蔗红糖与非转基因甘蔗红糖进行准确鉴别,为今后转基因甘蔗红糖的商业化所需的转基因食品鉴定提供技术支持,也为后面更为重要的转基因甘蔗白糖DNA的提取及分子鉴定提供借鉴。     

甘蔗液泡膜二羧酸转运蛋白基因ScTDT克隆与表达分析

【目的】克隆甘蔗液泡膜二羧酸转运蛋白基因（ScTDT）,并分析其在甘蔗不同组织及在铝胁迫下的表达模式,为深入研究该基因功能及抵抗铝胁迫的分子机制提供理论依据。【方法】利用同源克隆技术从甘蔗品种ROC22中克隆ScTDT基因,利用生物信息学软件进行序列分析,采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在甘蔗不同组织（根、茎和叶）及在铝胁迫（0、10和20μmol/L Al3+）下的表达水平。【结果】克隆获得的ScTDT基因,开放阅读框（ORF）全长1623 bp,编码540个氨基酸残基,蛋白相对分子量57.34 kD,理论等电点（pI）5.77,为不稳定的疏水蛋白,可能定位于质膜、液泡和/或高尔基体,其氨基酸序列与高粱（XP_002460443.1）、水稻（XP_015612609.1）和玉米（PWZ04635.1）的TDT氨基酸序列具有高度相似性,其中与高粱的TDT氨基酸序列相似性最高,达96.30%,说明ScTDT与高粱TDT的亲缘关系最近。ScTDT基因在甘蔗根、茎和叶中均有表达,但根中表达量显著高于茎和叶（P< 0.05,下同）。在铝胁迫处理下,3个甘蔗品种（ROC22、柳城05-136和中糖1202）的根中ScTDT基因表达量较对照组（0μmol/L Al3+）均显著升高,尤其是柳城05-136和中糖1202随着营养液中Al3+浓度增加,ScTDT基因的表达量呈显著升高趋势,说明高浓度Al3+胁迫更能诱导ScTDT基因高效表达。3个甘蔗品种中,以中糖1202的ScTDT基因表达量变化最大,柳城05-136次之,以ROC22的变化最小。【结论】克隆获得的ScTDT基因表达具有组织特异性,在根中高效表达可能与甘蔗抵抗铝胁迫相关,即植株通过上调根中ScTDT基因表达,从而加快液泡中苹果酸的释放,促使苹果酸从根中分泌到土壤与Al3+反应,从而减少铝毒害,表明ScTDT基因可能参与甘蔗抵抗铝胁迫,且不同甘蔗品种的抗铝胁迫能力有所不同。     

奶公犊的培育利用试验研究

通过对2组奶公犊进行饲养管理试验,分析养殖成本,探讨促进奶公犊生长发育和成活利用率的方法.结果表明:合理的饲养管理对犊牛的生长发育有积极的促进作用.试验Ⅰ组60日龄平均生长发育性能为:体重(76.0±11.8)kg,日增重(0.67±0.05)kg,胸围(94.0±3.0)cm,体高(83.6±2.6)cm:试验Ⅱ组60日龄平均生长发育性能为:体重(87.4±5.7)kg,日增重(0.84±0.07)kg,胸围(102.8±5.8)cm,体高(87.9±1.9)cm.犊牛的培育费用为(仅以精料和生奶计算):试验Ⅰ组大约为390.00元/头,试验Ⅱ组大约为580.00元/头.通过对2组的分析,试验Ⅰ组犊牛每头成本比试验Ⅱ组平均减少了190.00元.试验Ⅰ组犊牛的生长发育良好,饲养方案及日粮并没有影晌犊牛的正常生长发育.     

2020-01ml 目录

为了评价抗虫转基因甘蔗优良株系Bt2、Bt17对土壤生态环境造成的生态安全风险，采集抗虫转基因甘蔗Bt2、Bt17号株系及其受体非转基因品种ROC22甘蔗根际附近土壤，研究抗虫转基因甘蔗对其根际土壤蔗糖酶、酸性磷酸酶、中性磷酸酶及碱性磷酸酶的影响。结果表明，抗虫转基因甘蔗对其根际土壤酶活性的影响会因甘蔗生长周期、抗虫转基因甘蔗株系以及酶的种类而大有不同。Bt2的土壤酶活性在甘蔗生长的各个时期均未与对照存在差异，而Bt17对土壤酶活性的影响则较为复杂。与受体非转基因甘蔗品种ROC22相比，Bt17根际的土壤蔗糖酶活性在甘蔗生长的任何时期都无差异；而土壤酸性磷酸酶活性在甘蔗生长的各个时期均显著高于对照；中性磷酸酶活性则在苗期、分蘖期、成熟期显著高出对照，而在生长期与对照无差异；土壤碱性磷酸酶活性在苗期、生长期时与对照无差异，但分蘖期和成熟期显著低于对照，说明Bt2号株系对土壤酶活性并未产生影响，Bt17号株系对土壤酶活性可能产生较小的影响。     

云南甘蔗病毒性病害的分子鉴定

[目的]了解5种常见甘蔗病毒性病害在云南的发生情况,明确其病原病毒的种类和分布,为制定云南地区甘蔗病毒性病害的防治策略提供理论依据.[方法]利用PCR和RT-PCR对采集自云南保山、临沧和德宏3个甘蔗种植区的113份样品进行甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)、高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)、甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)、甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,SCYLV)和甘蔗杆状病毒(Sugarcane bacilliform virus,SCBV)的分子鉴定.[结果]113份甘蔗样品中有89份检出病毒,病毒检出率为78.8%,检出的病毒种类有SrMV、SCSMV、SCYLV和SCBV,检出率分别为5.3%、11.5%、20.4%和70.8%,未检出SCMV.30份样品存在病毒复合侵染现象,复合侵染率为26.5%,其中有27份样品为2种病毒复合侵染,占23.9%,3份样品发生3种病毒复合侵染,占2.7%;未发现4种或5种病毒复合侵染的现象.[结论]目前云南地区甘蔗病毒性病害由SrMV、SCSMV、SCYLV和SCBV引起,其中SCBV广泛分布,SrMV、SCSMV和SCYLV具有一定程度的分布;病毒复合侵染现象明显,以2种病毒复合侵染为主.     

52个甘蔗品种在广西受病毒侵染情况

为明确国家糖料体系甘蔗集成示范及区试品种在广西被病毒侵染情况,2017年从广西北海、南宁、崇左、百色、来宾、柳城、桂林等地集成示范及区试的52个甘蔗品种上采集带有甘蔗花叶病、甘蔗黄叶病和甘蔗杆状病毒病显著病症或不显病症叶片样品,采用特异引物通过RT-PCR和PCR方法进行5种病毒检测（甘蔗黄叶病毒、甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒、甘蔗花叶病毒和甘蔗杆状病毒）。结果表明,SCYLV的平均检出率为25.00%;SCSMV的平均检出率为7.97%;SrMV的平均检出率为7.69%;SCMV的平均检出率最低,为7.42%;SCBV的平均检出率最高,为68.41%,远远高于其他病毒。7个地方的甘蔗受病毒混合侵染现象普遍存在,北海的病毒混合侵染率甚至高于单一病毒侵染率。52个甘蔗品种在广西受5种病毒的总侵染率为79.67%,对甘蔗的生产安全存在着严重的潜在威胁,建议推广种植甘蔗脱毒种苗来缓解甘蔗病毒病害的危害。     

转Cry2A基因抗虫甘蔗植株的培育

Bt基因具有广谱杀虫性,培育转基因抗虫品种为甘蔗病虫害防治提供了新思路。为了检验Cry2A基因对甘蔗螟虫的防治效果,本研究构建了由玉米Ubi启动子驱动的Cry2A基因高效植物表达载体Cry2A-3300,利用农杆菌介导技术,对甘蔗胚性愈伤组织材料进行遗传转化,经过筛选培养及再生培养共得到46株抗性植株。对抗性植株进行PCR扩增检测,15株呈阳性;进一步利用RT-PCR,表明外源基因Cry2A在转录水平上得到有效表达。室内抗虫鉴定的结果表明Cry2A基因可有效抑制害虫的生长,这将有利于后期进行田间防治。     

甘蔗线条花叶病毒RNA沉默抑制子的寄主互作蛋白鉴定

甘蔗线条花叶病毒（Sugarcane streak mosaic virus, SCSMV）是引起甘蔗花叶病的一种主要病原。SCSMV编码的P1蛋白是RNA沉默抑制子,在SCSMV抑制寄主的RNA沉默防御中发挥关键作用,但其作用机制尚未清楚。与寄主蛋白互作是RNA沉默抑制子发挥其抑制作用的主要途径之一,因此鉴定与病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用机制的一个重要方法。为探究SCSMV P1抑制寄主RNA沉默的机制,本研究首先将SCSMV P1基因连接到质粒pGBKT7上构建诱饵质粒pGBKT7-P1,然后对pGBKT7-P1进行毒性和自激活检测,最后以pGBKT7-P1为诱饵,采用酵母双杂交技术从甘蔗cDNA文库中筛选与P1互作的寄主蛋白。结果显示,成功构建pGBKT7-P1诱饵质粒。将pGBKT7-P1诱饵质粒转入Y2H Gold酵母菌株后,酵母菌株在SD/-Trp平板及液体培养基中生长良好,表明pGBKT7-P1诱饵质粒对Y2H Gold酵母菌株无毒性。含pGBKT7-P1诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落未变蓝,在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA和SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板上无菌落生长,表明pGBKT7-P1诱饵质粒无自激活活性。用pGBKT7-P1诱饵质粒对甘蔗cDNA文库进行筛选,经SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板筛选1次及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA平板筛选3次后,获得42个阳性酵母克隆,提取阳性酵母质粒并导入大肠杆菌中扩大培养,经测序及blastx比对分析,获得13个可能与SCSMV P1互作的寄主甘蔗蛋白,分别是生长素应答蛋白IAA1、IAA15,转录因子NAC、GATA4、OFP4,真核翻译起始因子eIF5A,分子伴侣DnaJ,辅分子伴侣SBA1,重金属相关异戊二烯化植物蛋白HIPP35,mec-8和unc-52蛋白同系物抑制子SMU2,外膜孔蛋白OEP24,及2个未表征蛋白。基于这些蛋白的功能,推测P1可能通过与寄主蛋白互作来调控寄主防御反应相关基因的表达,和/或通过与寄主蛋白互作来影响寄主RNA沉默相关蛋白的合成、加工或转运,从而发挥其RNA沉默抑制子的功能。研究结果为后续深入解析P1抑制RNA沉默的作用机制奠定了重要基础。