猪繁殖与呼吸综合征病毒SGQ株M蛋白基因截断片段原核表达载体构建及其表达的初步研究

为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）M蛋白主要抗原表位基因序列,参照GenBank中发表的PRRSVSCQ株M蛋白基因设计并合成一对特异性引物,通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM（deletingM）,将其与pMD19-Tsimplevector连接,经测序正确后克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组表达载体pGEX-4T-1-dM,并将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,经IPTG于37℃诱导,PRRSVM基因获得表达。经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为35kDa。以纯化的重组蛋白作为抗原,经WesternBlot分析结果表明该重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SCQ株M蛋白基因截断片段原核表达载体构建及其表达的初步研究

为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白主要抗原表位基因序列,参照GenBank中发表的PRRSV SCQ株M蛋白基因设计并合成一对特异性引物,通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM(deleting M),将其与pMD19-T simple vector连接,经测序正确后克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组表达载体pGEX-4T-1-dM,并将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG于37℃诱导,PRRSV M基因获得表达。经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为35 kDa。以纯化的重组蛋白作为抗原,经Western Blot分析结果表明该重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测。     

C型口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及重组蛋白的纯化

利用PCR技术扩增获得C型口蹄疫病毒VP1基因,将其克隆到原核表达载体pET-30α(+)上,构建重组表达质粒pET-VP1。质粒pET-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导VP1基因的表达,收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE、Western blot分析,结果得到分子量约为33 ku的目的条带,表达产物占菌体总蛋白的35%,且该目的条带能被C型FMDV阳性血清识别,说明VP1基因在大肠杆菌中得到高效表达。融合表达蛋白经镍柱纯化,重组蛋白纯度达90%以上。     

轮状病毒VP4基因的克隆与核苷酸序列分析

用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从轮状病毒感染的细胞中扩增了816bp的VP4片段中抗原表位区.通过T4 DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM-T上,转化至受体菌DH5α中.提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定,证明重组质粒pT-V4中含有轮状病毒的VP4基因片段.经核苷酸序列分析,表明克隆了轮状病毒主要保护性抗原VP4基因中抗原表位区.     

鸡传染性贫血病毒衣壳蛋白的原核表达及免疫原性分析

将从组织病料中提取的鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)核酸进行PCR扩增,获得vp1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了CIAV vp1基因重组质粒,命名为pET32a-vp1。将 pET32a-vp1转化E.coli plys,重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE分析结果表明,vp1基因在大肠杆菌中成功表达。纯化的蛋白质作为包被抗原,ELISA鉴定结果表明具有良好的抗原性。本试验结果为进一步研究用重组抗原制备CIAV ELISA诊断试剂盒奠定了基础。     

鸡传染性法氏囊病血清抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立可检测鸡传染性法氏囊病血清抗体的间接ELISA检测方法,本研究经RT-PCR扩增IBDV VP2（1nt-708nt）基因片段,并应用pET28a载体进行原核表达,亲和层析纯化重组蛋白作为包被抗原,建立检测IBDV血清抗体的间接ELISA方法。应用所建方法和IDEXX试剂盒,对采自不同地区的156份鸡血清样品进行平行检测和比较。结果表明,RT-PCR扩增获得708bp的VP2基因片段;含重组表达质粒pET28a-VP2的大肠杆菌BL21经IPTG诱导后,表达了约27kDa的VP2重组蛋白,表达量约占菌体蛋白的30.1%;建立的间接ELISA检测方法与IDEXX试剂盒比较,其特异性、敏感性和符合率分别达到90.24%、95.65%和94.23%。由此可见,本研究所建立的间接ELISA方法敏感、特异,适用于IBDV血清抗体的检测。     

猫泛白细胞减少症病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达

根据猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus,FPV)GT-2株VP2蛋白全长基因序列设计1对特异性引物,以GT-2毒株为模板,PCR扩增VP2基因片段(去除终止密码子);与转座载体pFastBacI连接,构建重组质粒pFastBac-VP2,并进行测序鉴定;鉴定正确后,转化到含有辅助质粒的大肠杆菌DH10Bac中,将目的基因定向插入到Bacmid质粒中;经蓝白斑筛选后获得重组Bacmid-VP2,转染Sf9昆虫细胞。电镜负染结果表明:重组Bacmid-VP2在昆虫细胞中包装,形成了大量的杆状病毒粒子;VP2蛋白得到表达并形成了FPV病毒样颗粒。直接免疫荧光试验证明,FPV VP2蛋白在重组杆状病毒中获得了表达。利用双抗体夹心ELISA法检测病毒样颗粒的表达量,表明目的基因在昆虫细胞中获得了较高水平的表达。将表达蛋白作抗原免疫小鼠,经抗体测定证明表达的重组蛋白能诱导机体产生特异性免疫应答。     

口蹄疫病毒结构蛋白基因vp1的表达与应用研究

体外克隆口蹄疫病毒vp1基因，构建重组表达载体pET28a-vp1。将此重组质粒转化到受体菌BL21（DE3）中，进行诱导表达，SDS-PAGE和蛋白质印迹分析表明，诱导5h后表达量达到最高，表达产物大小约为33Ku-40Ku，表达蛋白能与口蹄疫病毒阳性血清产生特异性免疫反应。经HPLC纯化后，以重组蛋白为抗原，建立检测VP1蛋白抗体的ELISA方法，检测猪牛血清样品，免疫抗体检测结果与口蹄疫液相阻断ELISA检测结果呈正相关，能反映出免疫抗体动态变化，对临床样品口蹄疫病毒血清抗体检测，两种方法有一定相关性，但不显著。所以以重组VP1蛋白为检测抗原的ELISA方法有望用于口蹄疫免疫抗体监测。     

鸭肝炎病毒Ⅰ型结构基因vp1的原核表达及其抗原性分析

通过RT-PCR方法克隆出DHV-1：161／79／V结构蛋白vp1基因片段,将其克隆到pMD18-T载体中,测序结果为714bp。vp1经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,亚克隆到原核表达载体pET-32a（＋）,获得重组质粒pET—VP1,转入E．coli Rosetta-gami（DE3）pLysS,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测结果表明在大肠杆菌中表达了1个相对分子量约为47ku的融合蛋白（Trx-His—VP1）,将此融合蛋白用His-Ni^＋亲和层析法进行纯化。Westernblot分析表明,Trx-His-VP1能与DHV-1阳性血清发生特异性反应,说明表达的结构蛋白VP1具有良好的抗原性。     

水貂肠炎病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

为了对水貂肠炎病毒(MEV)疫苗免疫后抗体水平的监测和疫苗免疫效力的评价,本研究在分析MEV VP2蛋白抗原性的基础上,设计1对特异性引物克隆VP2蛋白抗原性较好的基因片段,将克隆的基因片段定向插入到pProEXHTb原核表达载体中,构建了VP2基因原核表达重组质粒pProEXHTb-VP2A,并实现在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,经鉴定表达的重组蛋白以包涵体形式存在,免疫印迹试验表明获得的重组蛋白具有与抗体较好的反应原性.应用His-Bind亲和层析柱纯化重组蛋白VP2A,以纯化后的重组蛋白作为ELISA诊断抗原,并对反应条件进行优化,初步建立了检测MEV抗体的VP2A-ELISA方法.确定了抗原最佳包被浓度为9.65 μg/mL,血清最佳稀释倍数为1:10.判定标准为S/P值≥0.312为阳性,S/P值≤0.243为阴性,介于两者之间为疑似.该抗原不与犬瘟热病毒、阿留申病毒阳性血清反应,具有良好的特异性.采用VP2A-ELISA对180份水貂血清样品进行检测,结果显示VP2A-ELISA与HI试验的符合率达到87.8%,表明建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性,为现地免疫貂群抗体检测和MEV流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法.