新疆石河子地区牛支原体的分离鉴定及药物敏感性分析

【目的】确定引起新疆石河子地区集约化牛场常发性肺炎的主要病原同时进行病原的体外药物敏感性分析。【方法】采集有典型咳嗽、流涕症状的牛鼻拭子10份和病死牛肺脏组织1份,用牛支原体特异性引物进行PCR检测,将检测为阳性的样本进行病原培养纯化,对纯化后的分离株菌落进行形态学观察、Dienes染色、生化试验及16S rRNA测序和进化分析,通过测定颜色变化单位(CCU)测定分离株生长曲线,并对分离株进行药物敏感性试验。【结果】PCR结果显示,10份鼻拭子中检测出7份牛支原体阳性样本,1份病死牛肺脏组织也检测为阳性;在涂有肺脏组织研磨液培养液的PPLO固体培养基上长出针尖状的菌落,纯化后分离株菌落形态为典型的煎蛋状;Dienes染色可见明显的深蓝色中心脐;生化试验结果显示,分离株不水解明胶、精氨酸、七叶苷,不发酵乳糖、葡萄糖和甘露醇,不分解尿素,可还原氯化三苯基四氮唑;16S rRNA测序结果显示,分离株与牛支原体国际标准株PG45相似性为99.7%,与国内牛支原体地方流行株XBY01、Ningxia-1、NM2012、Tibet-10的相似性最高,均为99.9%;生长曲线测定结果显示,分离株在培养基中生长6 h后进入对数生长期,54 h时达到高峰进入稳定期,72 h后进入衰亡期;药物敏感性试验结果显示,分离株对呋喃妥因、四环素和多西环素、庆大霉素和卡那霉素敏感,对诺氟沙星和氧氟沙星中介,而对环丙沙星、洛美沙星及阿奇霉素和红霉素耐药。【结论】本研究成功从肺脏组织中分离鉴定出1株牛支原体,培养54 h是该分离株的最佳收获时间,与国内大多数牛支原体地方流行株差异较小,整体遗传进化相对稳定,有一定的耐药性,本研究结果可为当地对牛支原体的防控提供参考,也为牛支原体致病机制研究及疫苗研发奠定基础。     

轮状病毒VP4基因和VP7基因原核表达载体的构建及表达

经PCR从含有VP4基因、VP7基因片段的重组质粒pT-VP4和pT-VP7中护增VP4、VP7基因，连接至pGEM-5zf( )。经筛选和鉴定正确后同时酶切目的基因和表达质粒pET-28a( )，连接、转化受体菌，经PCR、酶切和序列分析证明，连接向位和阅读框架是正确的，从而构建了轮状病毒保护性抗原VP4基因、VP7基因片段的原核表达载体pET28a-VP4、pET28a-VP7。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下，用SDS-PAGE、薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明，表达的目的蛋白以包涵体的形式存在，蛋白的分子量分别为37.69和36.20ku，表达量占菌体总蛋白的比例分别为17.1%和14.4%。     

轮状病毒VP4基因的克隆与核苷酸序列分析

用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从轮状病毒感染的细胞中扩增了816bp的VP4片段中抗原表位区.通过T4 DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM-T上,转化至受体菌DH5α中.提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定,证明重组质粒pT-V4中含有轮状病毒的VP4基因片段.经核苷酸序列分析,表明克隆了轮状病毒主要保护性抗原VP4基因中抗原表位区.     

哺乳动物中RNA干扰研究进展

RNA干扰(RNAi)由双链RNA引起,广泛存在于动、植物中的序列特异性转录后基因沉默,是生物体在进化过程中,抵御病毒感染及由于重复序列和突变引起的基因组不稳定性的保护机制。论文从RNAi现象、RNAi发生机制、哺乳动物中的RNAi现象和RNAi与抗病毒感染等几个方面做了综述,详细介绍RNAi在哺乳动物中的应用。     

轮状病毒VP4、VP7基因的克隆与核苷酸序列分析

用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，从轮状病毒感染的细胞中扩增816bp,916bp的VP4，VP7片段中抗原表位区。通过T4DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM-T上，转化至受体菌DH5α中，提取质粒经PCR扩增，酶切鉴定，证明重组质粒pT-V4,PT-V7中含有轮状病毒的VP4，VP7基因片段。经核苷酸序列分析。表明克隆了轮状病毒主要保护性抗原VP4，VP7基因中抗原表位区。     

致犊牛脑炎E.coli S9922生物学特性及对不同环境消毒剂抵抗力的测定

致犊牛脑炎大肠杆菌S9922是从7日龄以内死亡犊牛大脑中分离出的一株肠外致病性大肠杆菌Extrain?testinal pathogenic Escherichia coli(ExPEC),引发犊牛的脑炎及腹泻。为研究E.coliS9922的生物学特性以及对外界消毒剂的抵抗作用,试验对E.coli S9922进行了生化鉴定、血清学鉴定、溶血性试验、药敏试验和LD50的测定,同时测定了E.coli S9922对环境消毒剂稀戊二醛溶液、二氯异氰尿酸钠粉剂、苯扎溴铵溶液和聚维酮碘溶液的抵抗力。结果表明,E.coli S9922 V-P试验为阴性,吲哚试验为阳性,能发酵甘露醇、木糖、葡萄糖、鼠李糖、麦芽糖,且均能产酸不产气;在牛大肠杆菌27种常见血清型中,并未检测到E.coli S9922的血清型;在5%的兔血和5%绵羊鲜血平板上未见溶血圈;E.coli S9922对氯霉素、四环素、庆大霉素、环丙沙星、氨苄青霉素、卡那霉素,左氧氟沙星、头孢噻肟、青霉素耐药,对多粘菌素b和大观霉素不耐药,且具有多重耐药特性;LD50计算结果为107.238mg/kg,表明E.coli S9922是一株强毒株;在高浓度的消毒剂作用下,均能杀灭该菌,而在低浓度消毒剂作用下,稀戊二醛溶液和苯扎溴铵溶液比聚维酮碘溶液和二氯异氰尿酸钠的消毒效果好。研究结果可为肠外致病性大肠杆菌的研究提供试验数据以及对畜舍内环境消毒提供理论指导。     

食源性单增李斯特菌inlA/inlB/inlC基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为探究内化素inlA/inlB/inlC基因对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)生物学特性的影响,本研究采用融合PCR方法构建Lm681 inlC基因缺失突变体,并构建pKSV7-△inlC穿梭载体,将其转化Lm681-△inlAB感受态细胞,利用温度(42℃)和氯霉素(10μg/mL)抗性双重压力来实现同源重组,筛选同源重组子进行鉴定并研究其部分生物学特性。结果显示,PCR和测序结果证实成功构建了3基因缺失株(Lm681-△inlABC),且缺失株的生长特性与野生株相比无明显差异,溶血特性与野生株保持一致;小鼠感染试验显示,野生株Lm681、Lm681-△inlAB和Lm681-△inlABC对小鼠的致死率分别为80%(8/10)、60%(6/10)和40%(4/10),对小鼠的LD50分别为4.36×10~4、1.35×10~6和2.95×10~7 CFU,且Lm681-△inlABC在肝脏、脾脏及脑组织中的定植能力极显著低于野生株(P0.01)。研究结果表明,inlA/inlB/inlC基因对Lm致病性发挥具有一定的作用,为深入研究inlX基因介导Lm入侵宿主细胞过程中的作用机制提供了科学依据。     

乳杆菌Ⅰ及乳杆菌Ⅱ微生态制剂对雏鸡腹泻的防治及增重试验

试验用自己研制的两种微生态制剂乳杆菌Ⅰ、乳杆菌Ⅱ，分别混饲以防治蛋雏鸡腹泻，并测定增重情况，同时以土霉素混饲作对比。结果表明，饲喂乳杆菌制剂的两组腹泻发病率分别比土霉素组降低１％和１．５％，治愈率均为１００％。乳杆菌Ⅰ、乳杆菌Ⅱ防治雏鸡腹泻均优于土霉素，且乳杆菌Ⅱ效果更佳。增重试验中，１８日龄前，试验组与对照组增重差异不显著（Ｐ〉０．０５），１８日龄后差异显著（Ｐ〈０．０５）。     

食源性单增李斯特菌inlA/inlB/inlC基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为探究内化素inlA/inlB/inlC基因对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)生物学特性的影响,本研究采用融合PCR方法构建Lm681 inlC基因缺失突变体,并构建pKSV7-△inlC穿梭载体,将其转化Lm681-△inlAB感受态细胞,利用温度(42℃)和氯霉素(10μg/mL)抗性双重压力来实现同源重组,筛选同源重组子进行鉴定并研究其部分生物学特性。结果显示,PCR和测序结果证实成功构建了3基因缺失株(Lm681-△inlABC),且缺失株的生长特性与野生株相比无明显差异,溶血特性与野生株保持一致;小鼠感染试验显示,野生株Lm681、Lm681-△inlAB和Lm681-△inlABC对小鼠的致死率分别为80%(8/10)、60%(6/10)和40%(4/10),对小鼠的LD50分别为4.36×10~4、1.35×10~6和2.95×10~7 CFU,且Lm681-△inlABC在肝脏、脾脏及脑组织中的定植能力极显著低于野生株(P<0.01)。研究结果表明,inlA/inlB/inlC基因对Lm致病性发挥具有一定的作用,为深入研究inlX基因介导Lm入侵宿主细胞过程中的作用机制提供了科学依据。