T7 RNA多聚酶基因的克隆、序列测定及其在E.coli中的表达

从BL21(DE3)E．coli菌株中以PCR的方法扩增得到了与T7RNA多聚酶(T7RNApolymerase，T7pol)基因大小一致的DNA片断。将PCR产物纯化后直接克隆到pGEM—T载体中，经酶切鉴定和DNA序列分析表明克隆得到了正确的T7pol基因。将T7pol基因亚克隆入pET-28b( )中，构建得到原核表达质粒pET28T7。该质粒的BL21(DE3)pLysS转化菌在IPTG的诱导下可表达约98800的蛋白，这与T7pol的相对分子质量一致。将该质粒转化DH5α、JMl09、HBl01、BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS等5种不同的宿主菌，仅有转化T7pol酶活性受到抑制的宿主菌BL21(DE3)pLysS才能得到转化子，而其余4种T7T7pol酶活性不受抑制的E．coli宿主菌不能得到转化子。pET28T7原核表达质粒这种仅能在T7pol酶活性受到抑制的宿主菌中才能存活的现象说明本试验所克隆的T7pol基因能正确表达出具有RNA转录酶活性的蛋白。     

轮状病毒VP4基因的克隆与核苷酸序列分析

用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从轮状病毒感染的细胞中扩增了816bp的VP4片段中抗原表位区.通过T4 DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM-T上,转化至受体菌DH5α中.提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定,证明重组质粒pT-V4中含有轮状病毒的VP4基因片段.经核苷酸序列分析,表明克隆了轮状病毒主要保护性抗原VP4基因中抗原表位区.     

9株猪瘟分离毒株的致病特性

采用9株临床表现强、中、低致病特点的猪瘟野毒分离株第3代细胞毒作为种毒,按3mL/头剂量分别注射猪瘟抗原及抗体阴性猪,再用上一代传代猪发病后的血毒作为下一代接毒用种毒接种试验猪1头或2头,或上一代传代猪发病后,同圈放入1头或2头试验猪进行同居感染.如此进行,GDGZ1/95、BJCY1/96和JL1/94传至8代;FJFQ1/99传至7代;HeBHH1/95、HeNBY1/96、BJTX3/96、GXBH1/98和HeNXH2/98传至3代.结果显示:上述分离株传至3～5代过程中均表现出毒力增强的趋势,从3～5代传代到8(7)代的过程中毒力进一步增强并保持稳定,且均超过了标准石门强毒株的发病特点.所有试验猪均出现较典型的猪瘟临床症状,解剖后均表现出不同程度的病理变化,死后或解剖后的各种脏器经HCFA检查均为强阳性,这种现象进一步证实了猪是猪瘟病毒的敏感动物,各毒株之间毒力没有明显差异.对其中7株分离株传代血毒部分代次E2基因主要区域进行序列分析,结果仅GDGZ1/95株从F1～F8代中的F6代有2个核苷酸的差异,引起1个相应氨基酸的变异,其余毒株的不同代次没有碱基发生变异,初步说明猪瘟病毒基因型表现相对的稳定性.     

尼帕病毒和亨得拉病毒核蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

尼帕病毒（Nipahvirus，NiV）和亨得拉病毒（Hendravirus，HeV）是近年来出现的2种新的高致病性副粘病毒，在我国尚未发现。为防范2种病毒在我国的出现，本研究开展了前瞻性工作，成功研制了针对2种病毒核蛋白（N）的单克隆抗体，可用于病毒监测与诊断。首先利用大肠杆菌表达的2种病毒N蛋白免疫BALB／c小鼠，细胞融合后应用间接免疫荧光的方法对杂交瘤细胞克隆进行筛选，获得了5株N蛋白特异单抗。单抗腹水的抗体效价均超过2×10^5，培养上清抗体效价1：64～1：256。Western—blot和间接免疫荧光试验证明，5株单抗均特异针对N蛋白，其中1株（H4D11）只与HeVN蛋白反应，而不与NiVN蛋白反应，表明它具有鉴别2种病毒的能力。所研制的单抗对建立2种病毒的检测技术，用于动物监测，以防范2种新发传染病在我国流行具有重要意义。     

用荧光定量RT-PCR方法检测猪瘟病毒

为了建立能特异检测不同基因型猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),同时又能区分其他瘟病毒的基因检测方法,本实验针对CSFV基因组5′端非编码区设计并合成了简并引物和TaqMan探针,在优化反应条件的基础上,成功地建立了特异检测CSFV的荧光定量RT-PCR检测方法。再以已知滴度的CSFV石门株血毒总RNA反转录产物建立标准品,该标准品可以用于定量临床样品中的CSFV滴度,所建立的荧光定量PCR方法可以灵敏地检测出10~(-0.82)个TCID_(50)病毒含量。最后用建立的方法对108份临床样品进行检测并同时进行病毒分离,荧光定量PCR方法检测出73份阳性样品且与病毒分离的符合率为100%,而常规RT-PCR只检测出54份阳性样品,表明本荧光定量RT-PCR法在检测猪瘟病料上具有潜在的应用价值。     

人类艾滋病动物模型研究进展

许多疾病的研究离不开动物模型,它是进行发病机制、药物治疗和疫苗研究的必需条件之一。文章综述了近年来国内外建立艾滋病动物模型研究方面的新进展,包括了灵长类动物和非灵长类动物,并对建立艾滋病动物模型的发展前景进行展望。     

新型穿膜肽介导 p53融合蛋白的表达及其免疫原性分析

目的：原核表达新型细胞穿膜肽RDP介导p53融合蛋白,并检测其免疫原性的强弱．方法：以质粒pET28a‐p53为模板扩增p53基因,并克隆至原核表达载体pET28a‐RDP中,构建重组表达质粒pET28a‐RDP‐p53,转化至大肠杆菌Rosetta ,IPTG诱导表达蛋白并纯化,SDS‐PAGE确定该蛋白准确性．同时,将昆明小鼠分为空白对照组（等容生理盐水）和RDP‐p53融合蛋白高、中、低剂量（4 mg／kg ,2 mg／kg ,1 mg／kg）组,经腹腔注射免疫,每隔2 d给药1次,30 d后眼球取血,用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清中IgG的含量．结果：双酶切及测序结果显示, p53基因已克隆入表达载体中;RDP‐p53融合蛋白在上清和沉淀中均获得表达．ELISA测定结果表明,与对照组比较,低、中剂量组小鼠血清中IgG含量没有明显升高（p＞0.05）,高剂量组显著升高（p＜0.05）．结论：成功表达并纯化RD P‐p53融合蛋白,其免疫原性较弱且与给药剂量相关,为进一步研究RD P‐p53融合蛋白对脑肿瘤的药理作用奠定基础．     

Enterocin A在大肠杆菌中的表达及活性检测

将含有编码成熟Enterocin A的基因片段BAE2克隆到pET-28 a( )大肠杆菌表达系统中,在IPTG诱导下,工程菌表达了可溶性的融合多肽His tag-enterocin A,以金属鳌和层析对其进行纯化。利用琼脂扩散试验检测表达产物及纯化产物的抑菌活性。结果表明:His tag-enterocin A具有抗李斯特氏菌活性,但对所选用的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌不表现抑制作用,显示与Enterocin A相似的抑菌活性。     

轮状病毒VP4、VP7基因的克隆与核苷酸序列分析

用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，从轮状病毒感染的细胞中扩增816bp,916bp的VP4，VP7片段中抗原表位区。通过T4DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM-T上，转化至受体菌DH5α中，提取质粒经PCR扩增，酶切鉴定，证明重组质粒pT-V4,PT-V7中含有轮状病毒的VP4，VP7基因片段。经核苷酸序列分析。表明克隆了轮状病毒主要保护性抗原VP4，VP7基因中抗原表位区。     

质粒DNA拓扑学结构对基因疫苗生物学特性的影响

利用不同拓扑学结构的质粒 ,分别转化 E.coli感受态细胞、转染 SK6 - 6细胞和免疫小鼠 ,比较了不同拓扑学结构质粒对转化效率、转染率和对免疫应答水平的影响。结果显示 ,超螺旋占 5 0 %比例的猪瘟病毒 E2基因表达质粒p CDSW转化 E.coli感受态细胞的效率比开环的 p CDSW高 8倍 ,超螺旋比例占 80 %的 p VAXE2 IL- 2质粒比酶切线性化质粒转化率高 2 2倍 ;以荧光蛋白基因为报告基因 ,超螺旋比例占 80 %的荧光蛋白真核表达质粒转染真核细胞的效率是线性化质粒的 12倍 ;以猪瘟病毒主要保护性抗原 E2基因表达质粒 ,分别制备成超螺旋和开环形式占优势的质粒 ,免疫昆明鼠 ,抗体检测结果显示 ,超螺旋比例高的基因疫苗免疫效果明显好于开环质粒的基因疫苗