新疆石河子地区牛支原体的分离鉴定及药物敏感性分析

【目的】确定引起新疆石河子地区集约化牛场常发性肺炎的主要病原同时进行病原的体外药物敏感性分析。【方法】采集有典型咳嗽、流涕症状的牛鼻拭子10份和病死牛肺脏组织1份,用牛支原体特异性引物进行PCR检测,将检测为阳性的样本进行病原培养纯化,对纯化后的分离株菌落进行形态学观察、Dienes染色、生化试验及16S rRNA测序和进化分析,通过测定颜色变化单位(CCU)测定分离株生长曲线,并对分离株进行药物敏感性试验。【结果】PCR结果显示,10份鼻拭子中检测出7份牛支原体阳性样本,1份病死牛肺脏组织也检测为阳性;在涂有肺脏组织研磨液培养液的PPLO固体培养基上长出针尖状的菌落,纯化后分离株菌落形态为典型的煎蛋状;Dienes染色可见明显的深蓝色中心脐;生化试验结果显示,分离株不水解明胶、精氨酸、七叶苷,不发酵乳糖、葡萄糖和甘露醇,不分解尿素,可还原氯化三苯基四氮唑;16S rRNA测序结果显示,分离株与牛支原体国际标准株PG45相似性为99.7%,与国内牛支原体地方流行株XBY01、Ningxia-1、NM2012、Tibet-10的相似性最高,均为99.9%;生长曲线测定结果显示,分离株在培养基中生长6 h后进入对数生长期,54 h时达到高峰进入稳定期,72 h后进入衰亡期;药物敏感性试验结果显示,分离株对呋喃妥因、四环素和多西环素、庆大霉素和卡那霉素敏感,对诺氟沙星和氧氟沙星中介,而对环丙沙星、洛美沙星及阿奇霉素和红霉素耐药。【结论】本研究成功从肺脏组织中分离鉴定出1株牛支原体,培养54 h是该分离株的最佳收获时间,与国内大多数牛支原体地方流行株差异较小,整体遗传进化相对稳定,有一定的耐药性,本研究结果可为当地对牛支原体的防控提供参考,也为牛支原体致病机制研究及疫苗研发奠定基础。     

橡胶红根病生防深海真菌的筛选、鉴定及拮抗效果评价

橡胶树红根病是我国热带地区橡胶产业的毁灭性病害之一,严重影响我国橡胶产业的发展和热带人工林生态系统恢复。为克服实际生产中物理防治和化学防治的弊端,亟需寻找一种相对高效、安全的防治措施。随着科技发展和环境保护的需求日益扩增,生物防治成为病虫害防治最具发展潜力的研究方向。为了获得对橡胶树红根病病原菌具有较高拮抗活性的生防真菌,以橡胶树红根病的病原菌为靶标,以深海沉积物可培养真菌为指示菌,采用平板对峙法进行初筛,对有活性菌株进一步分别采用平板对峙法、对扣平板法与圆盘滤膜法测定发酵液、易挥发产物与难挥发产物等各自的抑菌率,全面评估其拮抗效果。结果表明,供试的56株深海真菌中,有9株具有平板对峙活性。复筛结果表明,9株真菌菌株发酵液、易挥发性代谢产物与难挥发性代谢产物对病原菌的的抑制率分别为–29.55%～48.45%、–3.56%～51.46%与–10.00%～50.00%。其中,菌株DSF034的发酵液、易挥发性代谢产物与难挥发性代谢产物对病原菌的抑制率分别为21.69%、32.04%与33.33%;菌株DSF073的发酵液、易挥发性代谢产物与难挥发性代谢产物对病原菌的抑制率则分别为48.4...     

布鲁氏菌分泌蛋白BspI生物信息学分析及多克隆抗体制备

【目的】试验旨在对布鲁氏菌分泌蛋白BspI进行生物信息学分析,构建原核表达载体,获得BspI蛋白并制备其多克隆抗体,为后续研究该蛋白的生物学功能提供材料。【方法】使用在线软件对BspI蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析,参照布鲁氏菌16M株BspI基因序列(GenBank登录号:DK63_1233)设计引物,PCR扩增目的基因后连接至pMD19-T克隆载体并筛选阳性克隆,将目的基因连接到pET-28a表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,加入IPTG诱导蛋白表达,并进行SDS-PAGE分析,用镍柱亲和层析方法纯化蛋白,纯化后的蛋白与弗氏佐剂混合免疫试验兔,采血分离血清,通过Western blotting、间接ELISA法进行多克隆抗体特异性及抗体效价分析。【结果】BspI蛋白为不稳定亲水性蛋白,存在跨膜结构,无信号肽区域,有13个磷酸化位点和7个抗原决定簇,二级结构主要由α-螺旋、延伸链和无规则卷曲组成。PCR成功扩增出675 bp的BspI基因,成功构建了pET-28a-BspI表达载体。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,成功表达出25.3 ku的蛋白,纯化后无明显杂带,制备的多克隆抗体能够特异性地与BspI蛋白结合。间接ELISA结果显示,BspI蛋白多克隆抗体效价为1∶409 600。【结论】制备的兔源BspI蛋白多克隆抗体可以特异性识别BspI蛋白,该蛋白具有较好的反应原性。试验结果为进一步研究BspI蛋白在布鲁氏菌的胞内寄生中发挥的作用提供了参考。