产肠毒素大肠杆菌肠毒素LTB、STⅠ和STⅡ融合基因的构建与表达研究

PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)LTB、STⅠ、STⅡ基因,将LTB、STⅠ、STⅡ基因重组入pET32a质粒载体,对构建的重组质粒pBST进行酶切分析、PCR检测以及核苷酸序列分析,结果表明,插入片段LTB-STⅡ-STⅠ的核苷酸序列与预期一致,且阅读框正确.pBST在宿主菌BL21(DE3)RIL中的表达产物经SDS-PAGE初步分析,显示重组融合蛋白的分子量约为40kD,其表达量约占菌体总蛋白的46%.     

口蹄疫病毒结构蛋白基因vp1的表达与应用研究

体外克隆口蹄疫病毒vp1基因，构建重组表达载体pET28a-vp1。将此重组质粒转化到受体菌BL21（DE3）中，进行诱导表达，SDS-PAGE和蛋白质印迹分析表明，诱导5h后表达量达到最高，表达产物大小约为33Ku-40Ku，表达蛋白能与口蹄疫病毒阳性血清产生特异性免疫反应。经HPLC纯化后，以重组蛋白为抗原，建立检测VP1蛋白抗体的ELISA方法，检测猪牛血清样品，免疫抗体检测结果与口蹄疫液相阻断ELISA检测结果呈正相关，能反映出免疫抗体动态变化，对临床样品口蹄疫病毒血清抗体检测，两种方法有一定相关性，但不显著。所以以重组VP1蛋白为检测抗原的ELISA方法有望用于口蹄疫免疫抗体监测。     

O型口蹄疫病毒VP1 T细胞与B细胞表位基因双拷贝串联表达产物的免疫应答

以一株O型口蹄疫病毒(FMDV)外壳蛋白VP1基因为模板,合成与细胞免疫及体液免疫相关抗原表位肽基因:21-40肽(20AA)和141-160肽(20AA)基因序列,运用基因工程技术构建了含有串联结构21-40(20AA)～141-160(20AA)～21-40(20AA)～141-160(20AA)的2020-2020VP1融合基因表达载体r2020-2020,转化宿主菌BL21(DE3)RIL后诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western Blot分析显示重组融合蛋白的分子量约为18Ku.动物实验表明,较小剂量的融合蛋白就能诱导豚鼠产生特异性T淋巴细胞增殖反应及抗FMDV中和抗体,证明该融合蛋白可同时激活细胞免疫及体液免疫反应,具有开发成为抗FMDV疫苗的应用价值.     

pXZ500融合蛋白提纯物和包涵体免疫效果比较

比较了ｐＸＺ５００融合蛋白提纯物和包涵体对豚鼠和猪的免疫效果，结果表明，ｐＸＺ５００融合蛋白提纯物与包涵体对这两种动物都具有同样良好的免疫效果。短型棒状杆菌作为生物佐剂对抗ＦＭＤＶ的免疫效果没有产生不利的或有利的影响。     

大肠杆菌热敏性肠毒素研究进展

大肠杆菌肠毒素是引起腹泻的主要致病因子，可以分为热敏性肠毒素和耐热性肠毒素两类。本文就热敏性肠毒素的理化性质、分子结构和生物学功能、免疫原性、免疫佐剂作用以及国内外对其免疫原性与佐剂效应的应用研究进行了综述。     

口蹄疫病毒VP1 T、B细胞表位与大肠杆菌肠毒素融合蛋白的免疫保护性研究

作者对O型口蹄疫病毒（FMDV）VP1双拷贝T细胞表位（aa 21-40）、B细胞表位（aa 141-160）融合蛋白2020-2020VP1及其与肠毒素大肠杆菌肠毒素融合后蛋白2020-B-2020和2020-B-2020-STI进行了免疫分析。动物试验表明,用2020-2020VP1、2020-B-2020和2020-B-2020-STI 3种融合蛋白分别免疫动物,免疫动物血清中均可产生针对FMDV的抗体。免疫豚鼠在低浓度FMDV刺激下能够产生特异性T淋巴细胞增殖反应,说明3种融合蛋白都能诱导机体产生FMDV特异性细胞及体液免疫反应。2020-B-2020和2020-B-2020-STI融合蛋白免疫雌鼠能够抵抗大肠杆菌强毒株攻击,免疫保护率如下：2020-B-2020 60%/1.5MLD,2020-B-2020-STI 100%/1.5MLD。2020-B-2020-STI免疫血清中具有STI中和抗体,且融合蛋白不具STI毒性。ELISA结果显示,2020-B-2020和2020-B-2020-STI能与霍乱毒素（cholera toxin）CTB抗体特异性结合。结果表明,2020-B-2020-STI具有开发成为口蹄疫及肠毒素大肠杆菌疫苗的应用价值。     

NSP—ELISA鉴别FMDV感染与免疫

利用大肠埃希氏菌表达的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)3ABC多肽作为抗原，建立了一种可区分FMDV感染与接种灭活疫苗免疫牛的间接酶联免疫吸附试验(I—ELISA)。通过对336份正常牛血清、508份注射疫苗牛血清、60份人工感染牛血清和58份豚鼠免疫血清的检测，确定了血清抗体阴性与阳性效价的临界值。试验证明，该方法简易、快速，灵敏度比VIAA—AGID高。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3B真核表达载体的构建及表达

设计、合成FMDV非结构蛋白3B基因的PCR引物，并在引物5’端和3’端分别加入含BamH I和HindⅢ限制性酶切位点序列。以FMDV基因组PNA为模板，利用RT—PCR技术扩增3B基因，得到的基因片段经BamH I/HindⅢ双酶切后与转座载体pFASTBAC HTa连接，转化宿主菌DH10BAC，在含庆大霉索、卡那霉索、X-gal、IPTC的LB平板上37℃培养24h，提取白色菌落，从中提取重组Bacmid 3B，与脂质体共同转染昆虫细胞8f9，得到重组杆状病毒，病毒经传代扩增后感染High5细胞，表达目的蛋白——FMDV非结构蛋白3B。SBS-PAGE及Westem Blot结果显示，本研究成功构建了Bacmid-3B重组表达载体，并在昆虫细胞中表达了NSP—3B蛋白，该表达产物可与MDV感染的猪、牛血清产生免疫反应。     

利用RNAi抑制口蹄疫病毒的复制

根据口蹄疫病毒 IRES和 L 串联序列两侧的保守区域设计了 2个引物 ,利用 RT- PCR和 PCR方法扩增出该串联序列 ,并进行了测序。测序结果表明 ,扩增产物与 Gen Bank上相应的序列具有很高的序列同源性 (大于 99% )。在测序的基础上 ,选择了 L 基因上的 1个靶位点 (位于启始密码子下游第 2 2 9nt后 2 1 nt长的序列 ) ,合成了 si RNA表达盒SEC- L2 2 9。细胞单层长成 5 0 %～ 70 %时 ,将纯化的 SEC- L2 2 9转染到 BHK细胞中 ,转染 4 h后用高感染复数 FMDV接种 ,2 4 h后用间接免疫荧光方法对口蹄疫病毒在 BHK细胞中的复制进行检测。研究结果表明 ,SEC- L 2 2 9极大地抑制了口蹄疫病毒在 BHK细胞中的复制 ,且该抑制作用具有序列特异性 ,并降低了 BHK细胞的死亡率。另外 ,2 5 ng和5 0 ng SEC- L2 2 9处理组间对病毒复制的抑制作用差异不明显 ,可能是病毒基因组发生了突变。本试验表明 ,利用 PCR方法合成的 SEC在 BHK细胞中能特异性地抑制 FMDV的复制 ,RNAi技术可能为防治口蹄疫提供一个新的途径     

口蹄疫非结构蛋白3ABC的融合表达及纯化研究

扩增了口蹄疫非结构蛋白3ABC基因，经双酶切后与表达载体pQE30Xa连接，构建了重组质粒pQE3ABC，并转化到宿主菌M15中进行表达，并对表达条件进行了优化。Western-blot结果表明，所表达的蛋白氨基酸序列正确，且表达的融合蛋白可与标准抗FMDV-O抗体特异性结合。本研究在大肠杆菌中成功地表达了口蹄疫非结构蛋白3ABC，为研制和开发口蹄疫感染和注苗动物鉴别诊断试剂盒奠定了基础。