口蹄疫病毒结构蛋白基因vp1的表达与应用研究

体外克隆口蹄疫病毒vp1基因，构建重组表达载体pET28a-vp1。将此重组质粒转化到受体菌BL21（DE3）中，进行诱导表达，SDS-PAGE和蛋白质印迹分析表明，诱导5h后表达量达到最高，表达产物大小约为33Ku-40Ku，表达蛋白能与口蹄疫病毒阳性血清产生特异性免疫反应。经HPLC纯化后，以重组蛋白为抗原，建立检测VP1蛋白抗体的ELISA方法，检测猪牛血清样品，免疫抗体检测结果与口蹄疫液相阻断ELISA检测结果呈正相关，能反映出免疫抗体动态变化，对临床样品口蹄疫病毒血清抗体检测，两种方法有一定相关性，但不显著。所以以重组VP1蛋白为检测抗原的ELISA方法有望用于口蹄疫免疫抗体监测。     

猪流感病毒表位抗原设计与串联表达策略

兽用疫苗的研发,一方面已经从传统减毒的或灭活的病原微生物发展到基因重组疫苗、亚单位疫苗、表位疫苗,从传统的病原学发展到细胞、分子乃核酸水平;另一方面,疫苗的功能已从单一的预防作用发展为预防性疫苗及治疗性疫苗。对疫苗进行设计与优化,已发展成为一门独立的新兴学科。新型疫苗的设计与研制,需要的是庞大的生物信息,如基因组学、蛋白组学、核酸与蛋白相互作用等信息。随着生物信息学的迅猛发展,计算机分析与生物学技术结合得越来越紧密,为生物疫苗设计提供了技术平台。2000年,Hagmann在《Science》上率先提出了“计算机辅助疫苗设…     

表达FMDV 3AB抗原生产菌株稳定性试验

重组表达菌株的稳定性是决定试剂盒抗原生产的关键因素,对本室构建的重组菌株rNS- 3ABplysS携带质粒和表达蛋白的稳定性进行了研究,在含Amp的斜面连续传1～10代时,分别作了检测连续传代质粒、携带质粒DNA、抗原蛋白表达的稳定性试验。发现各菌株携带质粒稳定性较好,酶切及电泳图谱未有明显改变,且外源目标蛋白可稳定表达,可作为理想菌株。     

利用噬菌体治疗大肠杆菌病和预防食源性病原0

噬菌体是一类能够感染和杀死细菌的病毒,这使其有可能成为抗生素的替代品而用于预防和治疗细菌性感染、减少农产品中的食源性病原体。噬菌体是安全的,因为其对动植物细胞没有侵害能力,并且由于其在自然界无处不在因而看来已经和细菌一起进化。噬菌体是在二十世纪早期由Twort（1915）和d’Herelle（1917）先后发现,是一类典型的病毒,具有蛋白质衣壳,衣壳中包含有核酸,核酸可以是DNA或RNA。噬菌体可分为两大类：强力型和温和型,二的生活史不同。     

大肠杆菌不耐热肠毒素突变体的表达及活性研究

利用重叠延伸PCR扩增技术,体外获得大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）突变体LTK63、LTR72和LTG192全基因片段,酶切和测序结果表明构建的表达载体pET30a-LT、pET30a-LTK63、pET30a-LTR72、pET30a-LTG192阅读框架正确,且相应位点氨基酸获得了替换。诱导表达产物用SDS-PAGE检测,野生型LT蛋白及3个突变体均表达出约33．0Ku和13．0Ku的2个蛋白带,与LTA、LTB亚基分子量大小相吻合;Westernblot检测,2个蛋白带均可与抗His抗体发生特异性免疫反应,而13．0Ku的蛋白带还可与抗霍乱毒素（cT）抗体发生免疫学反应。ADP-核糖转移酶活性试验分析,各突变体蛋白酶活性均低于野生型LT蛋白,但仍保留一些酶活性。Patent-mouse毒性试验检测,LTK63、LTR72和LTG192突变体蛋白的毒性均有不同程度降低,LTK63毒性降低最显著,TJTG192蛋白毒性相对较大。     

多重RT-PCR检测猪流感病毒及血清亚型

根据GenBank登录的猪流感病毒各血清亚型NP基因,H1、H3亚型HA基因,N1、N2亚型NA基因核苷酸序列,经DNAstar软件类比选择保守区设计引物,sPCR筛选出引物对,用于扩增猪流感病毒NP基因、血凝素H1/H3亚型、神经氨酸酶N1/N2亚型基因片段。根据NP、H1N1、H3N2亚型引物扩增片段大小和反应条件的差异,将各引物配比组合,形成引物组合,建立多重RT-PCR体系。经对不同亚型模板的扩增、检验,建立的2个多重RT-PCR体系可用于猪流感病毒及H1/H3血凝素亚型、N1/N2神经氨酸酶亚型的快速鉴别、诊断。特异性试验检测多重RT-PCR不能扩增其他猪病毒核酸,核酸的最低检测量达0.2ng。采集临床具有呼吸道症状的猪肺、鼻腔棉试子等85份,与鸡胚分离及血凝/血凝抑制试验比较,阴性样品检测符合率达100%。     

口蹄疫病毒3AB试剂盒的检测及比较

以重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB为检测抗原,研制了口蹄疫病毒非结构蛋白ELISA检测试剂盒,该试剂盒可用于判定被检动物是否感染口蹄疫病毒。重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB作为检测抗原包被酶标板反应孔,以辣根过氧化物酶标记的重组蛋白A/G作为第二抗体,建立了抗非结构蛋白抗体检测的方法。结果表明,在1 746份免疫猪血清中,3AB-ELISA对免疫猪血清的特异性为98.68%;在1 077份健康非免疫猪血清中,3AB-ELISA对健康非免疫猪血清的特异性为98.68%;在36份人工感染猪血清中,3AB-ELISA对阳性检出率为100%。而牛的特异性的各项指标和阳性检出率分别为94.04%,97.96%和100%。猪/牛口蹄疫病毒非结构蛋白酶联免疫吸附试验检测试剂盒与国外同类试剂盒比较,阳性检出率高出12.5个百分点。     

土耳其东毕吸虫原肌球蛋白基因的克隆

根据日本血吸虫原肌球蛋白cDNA序列和曼氏血吸虫的原肌球蛋白cDNA序列M27512的保守区设计引物，采用RT-PCR方法，成功克隆了土耳其东毕吸虫的原肌球蛋白全长cDNA序列。测序结果表明，TM序列全长1125bp，5’非翻译区为1bp～124bp，3’非翻译区为980bp～1125bp，开放阅读框为125bp～979bp，编码284个氨基酸。将该序列与其他血吸虫的序列进行同源性比较，结果与埃及血吸虫的TM同源性为90％，与曼氏血吸虫、日本血吸虫的TM同源性均为88％，该基因已经提交GenBank，序列号为》N560898。     

土耳其斯坦东毕吸虫原肌球蛋白基因的原核表达

将pGEM—TM质粒上的土耳其斯坦东毕吸虫原肌球蛋白（TM）基因片段亚克隆至原核表达载体pET28a（＋），重组的pET28-TM在大肠埃希氏菌BL21（DE3）中经1mmol／LIPTG诱导表达出-37．5ku的融合蛋白。该蛋白经Ni—NTA亲和层析柱纯化，SDS—PAGE检测，出现与目的蛋白大小一致的单一条带。Western-blotting检测结果表明，纯化的蛋白可被自然感染东毕吸虫的山羊血清识别，这为进一步研究东毕吸虫基因工程疫苗奠定了基础。     

重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的克隆与表达

口蹄疫（Food—and—mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Food—and—mouth diseasevirus,FMDV）引起的偶蹄动物共患的、接触性传染病。易感动物包括：牛、羊、猪、骆驼、鹿等80多种动物。FMDV有7种血清型、70多种亚型,变异性强,给病毒的防治造成很大困难。该病的发生可以导致地区甚至国家的畜产品进出口贸易受限,造成巨大的经济损失和政治影响。因此,建立准确、快捷的区分感染活病毒（发病或注射弱毒疫苗）和注射灭活疫苗动物的诊断方法在检测和防制FMD的发生、活畜检疫等方面都是十分迫切需要的。由于琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）,不能很好地鉴别自然感染和接种灭活疫苗的动物,因此存在着局限性,从而影响了鉴别诊断的准确。