胶体金方法检测H3和H7亚型禽流感病毒

用微波法制备金溶胶,对禽流感病毒(AIV)H3和H7亚型单克隆抗体(H3-1D6和H7-1F7)用亲和层析法进行纯化,优化单抗与金溶胶的最佳结合条件后,喷涂于玻璃纤维上制成金标垫.将纯化的马抗H3和H7亚型AIV多克隆抗体和山羊抗鼠二抗分别包被于硝酸纤维素(NC)膜上作为检测线和质控线,制备胶体金检测试纸条.用制备的试纸条对H3和H7亚型AIV标准抗原、毕赤酵母真核表达蛋白和已知样品进行检测,结果与血凝试验、血凝抑制试验、AC-ELISA和RT-PCR方法相符.同时用该方法对H5和H9亚型AIV标准抗原、病料以及传染性支气管炎、新城疫等抗原进行检测,结果均为阴性.该方法操作简单,肉眼于10 min内可判定结果,且达到了血凝试验和血凝抑制试验的敏感性.     

H5亚型虎源流感病毒血凝素单抗制备及胶体金试纸条的研制

以H5N1亚型虎源流感病毒免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA试验检测细胞培养上清,获得2株阳性杂交瘤细胞克隆株,命名为3A13和1B8.分别制备腹水后进行纯化,获得了抗H5亚型虎源流感病毒血凝素的单克隆抗体,用制备的单克隆抗体结合胶体金免疫层析技术,制备了H5亚型虎源流感病毒免疫胶体金快速诊断试纸条.该试纸条对H5N1虎源流感病毒鸡胚培养毒、H5亚型禽流感病毒标准抗原,以及24份虎疑似感染H5N1亚型虎源流感病毒感染病料和小鼠模型病料等检测结果为阳性,同时对H7和H9亚型禽流感病毒标准抗原及传染性支气管炎、新城疫抗原等检测结果为阴性;与HA-HI和RT-PCR的平行对比试验表明,试纸条检测敏感度与血凝试验和血凝抑制试验的敏感性相符.本试验所研制的免疫胶体金诊断试纸条可用于H5亚型虎源流感病毒的特异诊断和流行病学调查,为开发成品化检测试纸条奠定基础.     

H9N2亚型禽流感病毒中和单克隆抗体的制备与应用

为建立H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）免疫层析快速检测技术,本研究以差速离心法纯化H9N2亚型AIV免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合和HAT选择性培养;以H9N2亚型AIV感染MDCK细胞建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）的单克隆抗体检测方法,通过对杂交瘤细胞的IPMA筛选和连续克隆化筛选鉴定抗H9N2亚型AIV中和性单克隆抗体;以胶体金标记HA单克隆抗体,配对HA单克隆抗体和羊抗小鼠IgG为检测线和质控线,制备H9N2亚型AIV快速检测试纸条,测定其特异性和敏感性。结果显示,获得了11株稳定分泌抗H9N2亚型AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞,其单克隆抗体腹水IPMA效价在1.28×10^-4至2.56×10^-5之间。单克隆抗体3A2、5H6、6B8、7E10和9G12血凝抑制试验（HI）显示血凝抑制活性,其（HI）效价在6log2~9log2之间。单克隆抗体3A2、6B8和9G12在病毒中和试验中对H9N2亚型AIV有显著病毒中和活性,中和效价分别1∶6 400、1∶25 600和1∶25 600。Western blotting结果提示,该中和单克隆抗体识别HA蛋白线性抗原表位。利用配对单克隆抗体3A2和9G12研制的H9N2亚型AIV检测试纸条检测H9N2亚型AIV尿囊液的效价为9log2,灵敏度与经典血凝试验（HA）相当,与其他亚型AIV （H1、H3、H5、H7）,以及新城疫病毒和鸡传染性法氏囊病病毒等相关病毒均无交叉反应。本研究制备了具有病毒中和活性的抗H9N2亚型AIV单克隆抗体,并初步研制了H9N2亚型AIV检测试纸条,为H9N2亚型AIV新型疫苗研制和快速检测奠定良好的研究基础。     

H5亚型禽流感病毒荧光检测试纸条的研制

为了对引起家禽重大经济损失和具有公共卫生意义的H5亚型禽流感病毒(AIV)进行快速超敏检测,本研究研制了针对HA蛋白的4株单克隆抗体(MAb)杂交瘤细胞株,通过MAb的两两配对试验,以荧光量子点作为抗体标记生物材料,基于夹心法原理建立了H5亚型AIV荧光免疫层析检测试纸条。结果显示,该方法能够特异性检测出H5N1、H5N2等H5亚型AIV,而与H1N1、H3N2、H7N9、H9N2、NDV等其他病原无交叉反应;对标准检测抗原H5N1(Re-6)的最低检测量为1 ng/mL,比市售H5亚型AIV胶体金检测试纸条灵敏度高100倍;该方法的变异系数(CV)值在10%以内,与商品化的试剂盒检测结果符合率达99.8%。本文建立的H5亚型AIV荧光检测试纸条快速、敏感,检测结果准确可靠,为H5亚型禽流感的流行病学调查和快速诊断提供了基础。     

禽流感病毒荧光免疫层析检测试纸条的研制

禽流感是重要的人兽共患病,建立现场快速灵敏的检测方法是防控其发生和流行的前提和基础。本研究采用不同亚型流感毒株交叉免疫小鼠法来免疫小鼠,通过多个亚型的NP表达蛋白来筛选杂交瘤阳性细胞株,获得分泌针对NP蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞4株。通过抗体的两两配对,基于荧光量子点作为免疫层析抗体的标记探针,借助免疫层析试纸条双抗夹心法原理,筛选出了适用于免疫层析的两株单克隆抗体,研制了禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV )荧光免疫层析检测试纸条[A lateral-flow immunoassay strip with quantum dots(QDs)against AIV , AIV -QD-LFIA],并对该试纸条进行了特异性、敏感性、可重复性及可靠性分析。试验结果显示:本研究所建立的 AIV -QD-LFIA试纸条检测禽流感标准抗原H5N1-HK的敏感性达到104 EID50 ,检测标准抗原H9N2-HK的灵敏度为102 EID50 ,比商品化的禽流感病毒抗原检测卡灵敏度高100倍,比国家标准实时荧光RT-PCR(rRT-PCR)灵敏度低约100倍;可特异性地检测出H5亚型、H7亚型、H9亚型、H1亚型、H3亚型等A型流感病毒,与 IBV 、 NDV 等常见禽呼吸道传染病病原无交叉反应,且经过了国家流感中心标准样本盘的样品测试,特异性强;同时该法具有良好重复性,连续4周检测20个样品重复结果均为阳性;小规模田间试验显示该法用于禽流感病毒的普查监测结果可靠。可见本研究所建立的 AIV -QD-LFIA试纸条可满足禽流感病毒快速、高灵敏的检测需求,具有广阔的应用空间。     

H9和H6亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

试验旨在建立可同时鉴别检测H9和H6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）的二重RT-PCR方法。根据GenBank中H9和H6亚型AIV的HA基因保守序列,分别设计2对特异性引物,优化引物浓度与退火温度等条件,建立了可同时鉴别检测H9和H6亚型AIV的二重RT-PCR检测方法。用该法对H9和H6亚型AIV混合感染样品、H9亚型AIV单一感染样品和H6亚型AIV单一感染样品进行扩增,结果均得到对应的目的条带,而对其余亚型AIV及其他禽病病原体均未扩增出特异性条带。该法对H9和H6亚型AIV的检测下限均为5×10⁴拷贝/μL。本研究建立的二重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、稳定性和重复性良好,可同时鉴别检测H9与H6两种亚型AIV,为H9与H6亚型AIV的监测提供技术支撑。     

胶体金试纸条检测H9亚型禽流感病毒的研究

对禽流感病毒H9亚型血凝素单克隆抗体4C4进行胶体金标记,喷涂于玻璃纤维上制成金标垫,鸡抗AIVIgG和羊抗鼠IgG分别包被于硝酸纤维素（NC）膜上作为检测线和质控线,制作禽流感H9亚型免疫层析检测试纸条。验证结果表明,试纸条操作简单,肉眼于10min内可判定结果,对H9亚型禽流感病毒及其标准血凝抗原具有高度特异性,与其它亚型禽流感病毒标准抗原及其它禽类病毒没有交叉反应,检测灵敏度比HA试验高4倍以上。试纸条在室温保存6个月、4℃保存12个月,其特异性及灵敏度没有明显变化。对实验室送检及临床采集的共311份喉头拭子进行检测,结果与本室研制的禽流感ELISA试剂盒总符合率为92％,随机选取10份阳性样品经病毒分离证实无一误检。结果证明,本研究建立的H9亚型禽流感病毒免疫层析检测方法具有特异、敏感、稳定、操作简单快捷等特点,适合用于H9亚型禽流感病毒的现场检测及鉴别诊断。     

鸡细小病毒与H_9亚型禽流感病毒三重PCR检测方法的建立

为建立一种能够同时鉴别诊断鸡细小病毒、禽流感病毒且同时区分H9亚型禽流感病毒的检测方法,本研究根据GenBank中已发表的ChPV的NS基因、AIV最保守的M基因和H9亚型AIV的HA基因的保守序列,分别设计引物,并通过对温度和反应体系的优化,筛选出最佳的三对特异性引物组合,建立了一种能同时检测ChPV、AIV和H9亚型AIV的三重PCR检测方法。特异性试验结果表明,建立的三重PCR方法可以在一PCR反应中同时检测ChPV、AIV和H9亚型AIV,其它常见的禽病病原体均未见阳性反应,该三重PCR方法特异性良好;敏感性试验表明,该三重PCR检测方法对ChPV、AIV和H9亚型AIV的检测下限均为5×104拷贝/μL质粒;运用该法对130份临床样品进行检测,结果与ChPV PCR阳性产物测序及AIV分离测序结果完全一致。因此,本研究建立的ChPV和H9亚型AIV三重PCR检测方法是一种特异性良好、灵敏度高、简便有效的检测方法。     

禽流感病毒H5、H7和H9亚型一步法多重RT-PCR检测方法的建立

为了建立能同时检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的方法,参考GenBank中H5、H7和H9亚型AIV的HA基因序列的保守区域,利用Primer 5.0软件设计3对分别针对AIV H5、H7和H9亚型的特异性引物,预期特异扩增H5AIV片段大小为380bp、H7AIV为501bp、H9AIV为732bp。经过反应条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的一步法多重RT-PCR方法。该方法特异性强,对其他亚型AIV和禽呼吸道病原体检测结果为阴性;敏感性高,H5、H7和H9亚型AIV RNA的最低检出量分别为10-4、10-4、10-2拷贝/μL。初步建立了快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒的分子生物学诊断方法。     

禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒灵敏性试验

为了确定深圳出入境检验检疫局和深圳太太基因工程有限公司联合研制的禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒对H5和H9亚型禽流感的灵敏度，通过测定已知鸡胚半数致死量（ELD50）的标准毒株的进行了定量。利用9～11日龄SPF鸡胚，对深圳出入境检验检疫局保存的H5和H9亚型标准禽流感毒株进行了鸡胚半数致死量（ELD50）的测定，结果为H5亚型禽流感毒株的半数致死量为10^-7.75/0．2mL，H9亚型禽流感毒株的半数致死量为10^-8.5／0．2mL。用所研制的禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒对H5和H9亚型标准禽流感毒株原液进行10倍连续稀释，进行实时荧光RT-PCR灵敏度的测定，结果发现：试剂盒检测H5亚型标准禽流感毒株的灵敏度为标准毒株10^-5倍稀释液，该稀释液含有281ELD50病毒量；检测H9亚型标准禽流感毒株的灵敏度为标准毒株10^-8倍稀释液，该稀释液含有15．8ELD50病毒量。同时检测H5和H9时，试剂盒的灵敏度要比单独检测一个亚型时的灵敏度增加一个数量级。本灵敏度已经能够检测到感染鸡的喉拭子和（或）泄殖腔拭子所采集的病毒量，能够满足检验检疫的实际需要。     

1株野鸟源H7N3亚型禽流感病毒的全基因组序列分析及其对小鼠感染性研究

旨在对2021年分离自我国宁夏回族自治区野鸟粪便中的1株低致病性H7N3禽流感病毒(AIV)A/mallard/Ningxia/Y37/2021(H7N3)株进行了全基因组测序、遗传进化分析及对小鼠致病性试验。全基因组序列分析表明，HA基因裂解位点仅有1个碱性氨基酸，符合低致病性AIV的分子特性。遗传进化分析结果表明，HA基因和韩国野鸭源H7N7亚型AIV同源性较高；NA基因与韩国野鸟源H5N3亚型AIV同源性较高；PB2、PA基因与H5N2亚型AIV有较高的同源性；PB1基因与H5N3亚型AIV有较高的同源性；NP基因与H3N2亚型有较高同源性；M、NS基因与H3N8亚型有较高同源性，具有明显的遗传多样性。血凝抑制(HI)试验结果表明，该毒株与H7N9-Re4疫苗株抗血清的HI效价比同源毒株低16倍，抗原性差异显著。小鼠感染性试验结果显示，该病毒能在小鼠的肺部与鼻甲中复制，并引起感染小鼠体重下降，表明该毒株有感染哺乳动物的风险。本试验通过对1株野鸟源H7N3亚型AIV部分生物学特性的分析，为H7N3亚型禽流感的预警和综合防控提供重要理论参考。     

鉴别禽流感病毒H5、H7、H9亚型及N1-N9亚型RT-PCR方法的建立

快速检测和鉴定禽流感病毒(AIV)亚型对该病的防控具有重要意义。参考文献报道设计合成引物,采用二步RT-PCR方法,从H5/H7亚型AIV血凝抑制抗原和H9鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,建立禽流感病毒通用、H5/H7/H9亚型和N1-N9亚型鉴定方法。结果表明:针对AIV基质蛋白基因(M)和核蛋白基因(NP)的通用检测方法能有效扩增出目的条带;鉴别H5/H7/H9亚型的复合PCR扩增结果与预期目标一致;鉴别N1-N9亚型PCR方法扩增出N1/N2/N6/N9亚型目的条带;与其他4种常见病原无交叉反应。初步应用该方法检测样品,证明该方法对禽流感快速诊断和亚型鉴定具有潜在的应用价值。     

禽流感病毒H9N2亚型三重PCR检测方法的建立

为建立简便快速检测禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)并同时区分出H9、N2亚型的方法,本试验根据基因库中H9亚型AIV的HA基因、N2亚型AIV的NA基因及AIV的M基因序列,分别设计了3对针对这3种基因保守序列的引物,建立了AIV H9N2亚型的三重PCR检测方法。应用该方法对H9N2亚型AIV模板进行PCR扩增,可得到3条与试验设计相符的目的条带,分别为313 bp (HA基因)、451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9亚型的N2亚型AIV模板进行扩增,出现2条特异性扩增条带,即451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9、N2亚型AIV模板进行扩增则只出现一条目的条带,即667 bp(M基因);对其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。敏感性试验结果显示此三重PCR方法最低检出限为10^-2 ng/μL。应用所建立的三重PCR方法对120份临床病料进行检测的结果与病毒分离鉴定结果一致。各项试验结果均表明,该方法对于禽流感病毒尤其是H9、N2亚型禽流感病毒的检测具有快捷、特异、灵敏的特点。     

H7N9禽流感病毒纳米荧光颗粒试纸条的研制

为建立一种快速、敏感的H7N9禽流感病毒检测方法,以荧光纳米颗粒为标记物,采用免疫层析法制备H7N9荧光纳米颗粒试纸条,通过紫外灯下观察试纸条上的荧光信号来进行结果判定。结果表明:用制备的荧光纳米颗粒试纸条检测多个亚型禽流感病毒,只有H7N9禽流感病毒结果呈阳性,证实该试纸条具有较好的特异性;用该荧光试纸条与国家标准禽流感RT-PCR方法同时对200份样品进行检测,符合率达到935%。本试验研制的纳米颗粒荧光试纸条可用于H7N9禽流感病毒现场快速检测,具有广阔的应用前景。     

H3N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

为建立检测禽流感病毒(AIV)且同时区分H3N2亚型AIV的方法,本研究根据H3、N2亚型AIV HA、NA基因及AIV最保守M基因的保守区域,设计并筛选出3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了AIV H3N2亚型和M基因三重RT-PCR的检测方法。对该法进行特异性及敏感性检测,并通过该三重RT-PCR方法对96份临床样品进行检测。结果显示,H3N2亚型AIV可扩增出3条特异性条带,其中518bp为AIV M基因、418bp为N2亚型AIV NA基因、271bp为H3亚型AIV HA基因;H3亚型和N2亚型AIV均可扩增出2条特异性条带,大小分别为518bp、271bp和518bp、418bp;其他亚型AIV可扩增出一条特异性条带,大小为518bp;常见禽病病原体均未扩增出任何条带。敏感性试验表明该法对H3N2亚型AIV的检测下限为100pg,96份临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究所建立的AIV H3N2亚型和M基因三重RT-PCR为一种简便、快速、有效的检测方法。     

H9型禽流感毒株免疫对H5型禽流感抗体检测的干扰试验

利用禽流感病毒（AIV）美国H9型毒株，江门H9型毒株和广东某厂厂家生产的含AIV毒株的几种禽用商品疫苗分别免疫40日龄的肉用鸡，通过首免和超免疫后采集首免血和超免疫血分离血清，分别用自制H5型抗原（美国毒株），广州H5型抗原（香港毒株）和中国农业科学院哈尔滨兽医研究所H5型抗原对上述免疫鸡血清进行血凝抑制试验（HI），测定这些H9型毒株免疫的抗血清对H5型抗体检测的影响，试验结果表明，单纯的H9型毒株免疫的抗血清不构成对H5型抗体检测的影响，而含AIV抗原的商品疫苗免疫的鸡血清部分显示H5型抗体阳性，说明某些商品疫苗中含H5型抗原，用美国H5型毒株免疫的鸡血清进行反向验证试验，也未发现对H9型抗体检测的影响，表明H5和H9型AIV不存在同源抗原，因而在二者抗体检测中不存在相互干扰的问题。     

H5、H7和H9亚型禽流感病毒四重荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

旨在提高对禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）检测效率，及时发现疫病。本研究通过分析M基因以及H5、H7和H9亚型的HA基因序列保守区域，设计并合成了相关探针和引物，建立了禽流感病毒（AIV）四重荧光RT-PCR检测方法，该方法可在检测禽流感病毒（AIV）的同时，确定病原是否为H5、H7和H9亚型。结果显示，该检测方法耗时短、特异性好、检测下限达到10^-5 ng·μL^-1。采用该方法检测临床采集的13个活禽交易市场的384份禽咽喉和泄殖腔双拭子样品，经检测，其中有60份样品为流感病毒阳性，且全部是H9亚型，该结果与行业标准方法（NY/T 772—2013）检测结果一致，κ值为1（P<0.001）。本方法能实现对禽流感病毒及H5、H7和H9亚型的高通量快速检测，将在AIV快速检测中发挥重要作用。     

鲁北地区商品肉鸭AIV和NDV抗体效价的检测与分析

为了解鲁北地区商品肉鸭中禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)的母源抗体、免疫抗体消长规律,分析在养殖过程中潜在的疫病风险,选择了三个规模化鸭场,分别采集了不同日龄鸭的血液样品,通过血凝试验和血凝抑制试验检测了AIV H5亚型(Re-6,Re-8)、H9亚型、H7亚型和NDV的抗体情况。结果表明:三个鸭场的AIV H5亚型和NDV抗体效价均处于较高水平,说明AIV H5免疫后的抗体能够产生有效保护,AIV H9亚型母源抗体在肉鸭12日龄左右消失,存在被感染的隐患;仅有两份血清样品检测到AIV H7亚型抗体效价,其余都为0;NDV在鸭群中存在不同程度的隐性感染。建议做好对AIV和NDV的抗体监测工作,并为防控相关疾病做好技术与产品储备。     

禽流感病毒RT-PCR及多重RT-PCR检测技术的建立

研究建立了禽流感病毒（AIV）A型、H5、N1、H9、N2亚型特异性RT-PCR及HS／N1、H9／N2、A／H5／Nl多重RT-PCR检测技术，用于检测或同时检测和鉴别A型及H5N1、H9N2亚型AIV。所建立的RT-PCR和多重RT-PCR从核酸提取、基因扩增到产物分析在3～4h内即可完成，经对36株AIV及相关病毒分离物检测，与病毒分离鉴定的结果完全一致，且与相关病毒或其他亚型无交叉反应。采用多重RT-PCR检测80份棉拭子样品，并与病毒分离鉴定方法比较，二者H5N1、H9N2亚型的鉴定结果完全吻合。结果表明，该方法具有快速、敏感、特异等优点，为临诊样品中AIV型及H5N1、H9N2亚型鉴定和诊断的有效方法。     

禽流感病毒 H3N2亚型三重 RT-PCR 检测方法的建立

为建立检测禽流感病毒（AIV ）且同时区分 H3N2亚型AIV 的方法,本研究根据 H3、N2亚型AIV HA、NA基因及AIV最保守M 基因的保守区域,设计并筛选出3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了AIV H3N2亚型和M 基因三重RT‐PCR的检测方法。对该法进行特异性及敏感性检测,并通过该三重RT‐PCR方法对96份临床样品进行检测。结果显示,H3N2亚型AIV可扩增出3条特异性条带,其中518 bp为AIV M 基因、418 bp为N2亚型AIV NA基因、271 bp为H3亚型AIV HA基因;H3亚型和N2亚型AIV均可扩增出2条特异性条带,大小分别为518 bp、271 bp和518 bp、418 bp;其他亚型AIV可扩增出一条特异性条带,大小为518 bp;常见禽病病原体均未扩增出任何条带。敏感性试验表明该法对 H3N2亚型AIV的检测下限为100 pg ;96份临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究所建立的AIV H3N2亚型和M 基因三重RT‐PCR为一种简便、快速、有效的检测方法。