斑点叉尾(鱼回)血清免疫球蛋白纯化及其结构分析

通过饱和硫酸铵分步盐析结合柱层析纯化温和气单胞菌免疫的斑点叉尾(鱼回)血清免疫球蛋白(Ig),结果表明,斑点叉尾(鱼回)血清Ig主要分布在35%～55%的硫酸铵沉淀区间;而在Sepharose-4B凝胶柱和DEAE-52阴离子交换柱层析纯化的Ig均出现在第1个蛋白质峰.SDS-PAGE分析表明,纯化后的血清Ig纯度提高.通过变性还原、变性非还原和非变性非还原3种条件下的免疫印迹(Western blot)试验对血清Ig的结构进行初步分析,发现SDS变性还原条件下血清Ig重链分子量为72 kD,轻链有3条,其分子量分别为21 kD、23.5 kD和26 kD;在变性非还原条件下血清Ig则出现多种结构形式,主要条带的分子量分别为760 kD、525 kD、330 kD和230 kD;而在非变性非还原条件下Ig仅出现一种结构形式,分子量约为870 kD.     

鳗源嗜水气单胞菌L316主要外膜蛋白基因克隆和序列分析

根据已发表嗜水气单胞菌（AH）的外膜蛋白基因（Omp）的核苷酸序列设计1对特异性引物,应用PCR技术,扩增AHL316的主要外膜蛋白基因（Momp）,经T/A克隆,插入到pGEM-T系列载体上进行序列测定,结果表明Momp基因最长的开放阅读框（ORF）为1 035 nt,编码由分子量为36 kD的主要外膜蛋白（MOMP）,其与国外AH分离株AF146597的Omp基因的核苷酸的同源性达96%,氨基酸的同源性达98%.应用分子生物学软件分析表明此主要外膜蛋白前24个氨基酸是较强的疏水性区域,可形成信号肽,有跨膜区,经与其他外膜蛋白系统发育进化分析表明,该蛋白属于ompA蛋白家族.     

猪伪狂犬病病毒囊膜蛋白免疫刺激复合物的制备

以非离子去污剂Mega-10裂解病毒囊膜蛋白，与新型佐剂ISCOM基质作用，应用离心和透析相结合的方法制备了猪伪狂犬病病毒囊膜蛋白免疫刺激复合物（PRV－ISCOMs）。PRV－ISCOMs经磷钨酸负染后电镜观察见到囊膜蛋白分布在ISCOM颗粒表面，形成直径30－40nm的笼格状结构，同时将PRV－ISCOMs在－20℃冻融5次后经电镜观察仍见到典型的笼格状结构，与国外报道的形态一致，本结果证实我们成功地制备了具有良好稳定性的PRV－IS－COMs。     

番鸭细小病毒和鹅细小病毒二联弱毒细胞苗的研究

应用适应于番鸭胚成纤维细胞(MDEFC)上繁殖，并产生细胞病变的鹅细小病毒(GPV)弱毒疫苗株与番鸭细小病毒(MPV)弱毒疫苗，按适当比例混合，试制了MPV—GPV二联弱毒细胞苗，并测定了各项免疫指标。结果显示：试制出的二联苗对1日龄雏番鸭具有良好的安全性和遗传稳定性；免疫后5d和7d攻击GPV强毒，保护率分别为75％和100％，同时免疫后7d血清中MPV—胶乳凝集抑制(LPAI)抗体效价均大于2^1，21—28d抗体达高峰，有效免疫期超过60d。疫苗于-20℃保存期大于12个月。上述结果表明，二联弱毒细胞苗安全有效。     

日本鳗鲡败血腹水病病原研究

2000年3月中旬，自福建仙游某日本鳗鲡（Anguilla japonica)养殖场患败血腹水症的发病日本鳗鲡的肝脏及腹水处分离到四株细菌，经鉴定其中一株为迟钝爱德华氏菌（dwardsiella tarda)，一株温和气单胞菌（Aeromomas sobria)和两株嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila)溶血试验，小鼠攻毒试验显示，上述四株细菌都有较强制 毒力，综合分析，上述菌株可能是引发这次日本幼鳗败血腹水病之病原菌。     

嗜水气单胞菌胞外产物的生物活性及主要蛋白型分析

在血清学分型的基础上制备了23 株嗜水气单胞菌和1 株温和气单胞菌的胞外产物。分析这些菌株的溶血活性、蛋白酶解活性和细胞毒活性。结果表明,上述3 种生物学活性与菌株血清型间没有严格的对应关系。SDS PAGE分析显示,胞外产物的SDS PAGE图谱主要包括35 ku,45 ku,53 ku 3个主要蛋白质条带。有别于此前的多数报道,35 ku的蛋白质条带为多数菌株(22/24)所共有。根据凝胶上主要蛋白条带在不同菌株中的分布,可初步将其中的18 株细菌分为3 个胞外产物ECPs蛋白型,该ECPs蛋白型显示与血清型有一定的对应关系。经蛋白酶K消化处理的ECPs,银染可见脂多糖(LPSs)的典型O 糖侧链结构,显示脂多糖是组成粗制ECPs的重要组分之一。     

鸡传染性喉气管炎病毒单克隆抗体的特性和应用

应用鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）作免疫原建立８株分泌抗ＩＬＴＶ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞株。这８个ＭｃＡｂ均具有ＦＡ特性、没有中和病毒能力，它们分别属于ｌｇＧ２ａ、ｌｇＧ３和ｌｇＭ。应用异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）标记ＭｃＡｂ，建立直接荧光抗体试验（ＤＦＡ），检测ＩＬＴＶ抗原与分离病毒，其符合率为９２．８％。ＤＦＡ具有准确、快速、方便等特点。     

创伤弧菌外膜蛋白免疫刺激复合物最小免疫剂量测定

为探讨创伤弧菌Vibrio vulnifiticus外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)免疫刺激复合物(Immune stimulating Complexs,ISCOMs)的抗原性,制备创伤弧菌OMP-ISCOMs腹腔注射免疫欧洲鳗鲡Anguilla anguilla(平均规格为17g·尾-1),通过免疫血清学检测和攻毒保护试验,测定ISCOMs最小免疫剂量。结果表明,于免疫后第30d用FJ03-X2菌株攻毒,免疫组40、20、10、5μg·尾-1的免疫保护力分别为100%、87.5%、75%、50%;免疫血清效价分别为1∶6 400、1∶3 200、1∶800、1∶200。结果说明创伤弧菌外膜蛋白ISCOMs的最小免疫剂量为0.59μg.g-1水温(24±1)℃,并证实了创伤弧菌OMP-ISCOMs具强抗原性。     

鳗鲡疱疹病毒ORF95基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

鳗鲡疱疹病毒(Anguillae herpesvirus,AngHV)是淡水鳗鲡的主要病毒性疾病病原之一。根据鳗鲡疱疹病毒(AngHV-1)的基因组序列(GenBank:NC-013668)设计引物,扩增鳗鲡疱疹病毒福建株(AngHV-FJ)ORF95基因的开放阅读框序列,克隆至pMD19-T载体;经限制性内切酶酶切和测序鉴定,进一步将其克隆至原核表达载体pET-32a,构建了表达质粒32a-ORF95,将其转化表达菌株BL21(DE3),经IPTG诱导,实现了ORF95在大肠杆菌中的高效表达。在0.1mmol.L-1 IPTG、23℃诱导14h的条件下,可溶性ORF95蛋白的表达量较高,经镍柱纯化获得了高纯度的融合蛋白。     

猪源2型链球菌福建株CPS2J基因PCR检测及序列分析

设计并合成一对扩增2型猪链球菌CPS基因的特异性引物,以猪2型链球菌福建株DNA为模板,筛选最佳反应条件,建立检测CPS2J基因的PCR方法,并对PCR扩增产物进行序列测定和同源性比较分析。结果如下：应用该方法对猪2型链球菌福建株和标准阳性株进行扩增,均获得与预期大小一致的675bp特异性目的片段,而对8株非2型猪链球菌的扩增结果均呈阴性;敏感性测定最低可检出100cfu细菌量或50pg 细菌DNA;SS2PFJ06CPS2J 基因部分核苷酸及其推导的氨基酸序列与猪链球菌2型不同菌株的同源性分别达98.7%-100%和97.8%~100%。上述结果表明建立并优化的猪2型链球菌CPS2J基因的PCR检测方法敏感性好、特异性高,能用于2型猪链球菌的分子流行病学调查和快速检测; 序列分析表明猪2型链球菌福建株与国内外8株标准株之间同源性高、亲缘关系密切。