福建省欧鳗二极虫病流行情况初步调查

１９９６年１０月至１９９７年１１月我们对福建三十多个鳗场欧鳗二极虫病情况进行初步调查。结果表明,９０％以上鳗场均发生过二极虫病,欧鳗各阶段均可感染,其中白仔感染率为９２．８％,黑仔７８．３％,幼鳗８１．６％,成鳗５３．５％;各器官组织中平均检出率肾脏７１．２３％,鳃３５．６１％,皮肤１３．０％,肠８．２％。     

嗜水气单胞菌细胞外膜蛋白及S层蛋白分析

用十二烷酰肌氨酸盐抽提结合超速离心纯化，制备了19株典型嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila)和1株温和气单胞菌（A.sobria)的主要外膜蛋白（MOMP）。根据SDS-PAGE图谱，将其中的14株菌分为3个MOMP组，I组的主要蛋白带为40kD和43kD，Ⅱ组的主要蛋白带为40kD和50kD,Ⅲ组的主要蛋白为40kD、46kD和50kD.MOMP组和血清型间没有严格的关系。用兔抗嗜水气单胞菌体抗原为第一抗体进行免疫印迹实验。结果显示，所有被试菌株都能产生强阳性反应，其中40kD的蛋白带为大多数菌株所共有，且具有相似的免疫原性，是构成菌体抗原的重要免疫原。用0.2mol/L甘氨酸缓冲液（pH4.0)处理上述菌株培养物，结果仅有嗜水气单胞菌ZY01-g3能够分离到丰富的S层样蛋白，其分子量约为52kD，而分子量约为52kD，而其他菌株未能分离到典型的S层样蛋白，表明S层蛋白的分布有限。     

番鸭小鹅瘟病毒的分离与鉴定

从临床表现腹泻、肠粘膜脱落形成栓塞为特征的发病雏番鸭肝、脾中分离到2株病毒（命名为GPV-PT株和GPV-F株）,分离株在间接免疫荧光抗体试验（IFA）和琼脂扩散沉淀（AGP）试验中只与GPV单抗反应,与MPV、NDV、IBDV单抗和DHV阳性血清均不发生反应;电镜观察见到实心和空心两种粒子,无囊膜,圆形,呈立体对称,直径20～24 nm;分离株无血凝活性;对紫外线和胰蛋白酶均不敏感;对番鸭胚的ELD50为lg6.5;雏番鸭人工感染病毒后出现与自然病例相似的症状,并回收到病毒。上述结果表明分离的2株病毒均为番鸭小鹅瘟病毒。     

中华鳖虹彩病毒的纯化及分析

为制备高纯度的中华鳖虹彩病毒,分析其免疫相关抗原,采用3种方法纯化中华鳖虹彩病毒粒子并对其结构蛋白进行了初步分析.结果表明:差速离心法回收的样品中病毒纯度差、密度低,在电镜下不易观察到病毒粒子;病毒培养物经冻融、磁力搅拌、超声处理后,进行差速离心可提高病毒的回收率,但超声处理易造成病毒结构破坏;病毒培养物经离心浓缩、匀浆、磁力搅拌处理,再通过差速和蔗糖密度梯度二步离心纯化后,在蔗糖密度为30%～40%、40%～50%和50%～60%之间分层的样品中均可观察到病毒粒子,其中,蔗糖密度为50%～60%之间回收的病毒粒子纯度最高,且结构完好.SDSPAGE分析表明,纯化病毒至少含20条蛋白条带,分子量为50kDa的核衣壳蛋白是中华鳖虹彩病毒的高丰度蛋白.Western-blot分析结果证实大多数蛋白条带能被鼠抗中华鳖虹彩病毒高免血清特异性地识别.     

福建省欧洲鳗寄生虫病调查初报

１９９６年１０月至１９９９年８月对福建６８个欧鳗养殖场进行了欧鳗寄生虫病初步调查,结果表明：欧鳗寄生虫病流行范围广,周期长,共查出１３种寄生虫为原虫８种,蠕虫５种,其中车轮虫,两极虫,小瓜虫和拟指环虫危害最为严重,阳性检出率分别高达７８％、７６％、５７．１％和３３．５％。     

鳗鲡疱疹病毒的分离与鉴定

为获知鳗鲡"脱粘败血病"与病毒的关系,实验用蔗糖密度梯度离心的方法从发病的欧洲鳗鲡内脏器官组织匀浆液中纯化了病毒粒子,负染后利用电镜观察;进一步用EO细胞对病毒进行了分离、培养,并对感染病毒的细胞进行超薄切片,电镜观察;然后,提取病毒DNA,利用鳗鲡疱疹病毒的PCR检测方法对其进行了鉴定。结果显示,接种匀浆上清液的EO细胞出现细胞融合的病变效应;分离病毒的病毒粒子具囊膜,大小约为200 nm;从感染病毒的细胞上清液DNA中扩增出特异性条带,序列测定与比对分析表明,该序列与鳗鲡疱疹病毒欧洲株(AngHV-1)的序列完全一致。研究表明,利用EO细胞分离了一株鳗鲡病毒,经形态观察和DNA分析,确认该病毒为鳗鲡疱疹病毒,命名为AngHV-FJ。该研究为深入开展鳗鲡疱疹病毒的致病机制及鳗鲡"脱粘败血病"的防控研究奠定了重要基础。     

鳗鲡疱疹病毒FJ株ORF51基因的克隆及生物信息学分析

为了解本课题组分离的鳗鲡疱疹病毒福建株（AngHV-FJ） ORF51的结构特征,扩繁了 AngHV-FJ ,提取其基因组DNA ,经PCR扩增,获得ORF51基因,将其克隆至pMD19-T载体中,进行DNA测序,用生物信息学方法分析AngHV-FJ ORF51基因及其编码蛋白的结构和功能。结果显示,扩增到长约720 bp的ORF51基因序列,其与GeneBank上鳗鲡疱疹病毒欧洲株（AngHV-1） ORF51基因的序列完全一致。该基因编码239个氨基酸;预测ORF51基因编码蛋白的分子量为26107.1 Da ,等电点为7.66,是疏水性蛋白且偏碱性;有4个跨膜域;抗原表位预测显示抗原性较好;结构预测显示,存在1个N-糖基化位点、1个O-糖基化位点、10个磷酸化位点;亚细胞定位预测显示其主要存在于内质网。本研究为解析ORF51的功能及开展AngHV的基因工程疫苗研究奠定了基础。     

鳗鲡疱疹病毒ORF51基因的原核表达及多克隆抗体的制备

将鳗鲡疱疹病毒(AngHV)福建株(AngHV-FJ)ORF51基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建表达质粒pGEX-4T-2-ORF51,将其转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导后,收集表达菌体,进行SDS-PAGE分析和免疫印迹试验验证,结果表明,获得了高效表达的AngHV-FJ ORF51融合蛋白.经割胶回收纯化,获得高纯度的融合表达蛋白.用纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的兔抗ORF51多克隆抗体.这为进一步研究ORF51蛋白的结构和功能及开展AngHV病的防治研究提供了重要的研究基础.     

欧洲鳗免疫球蛋白单克隆抗体的制备与特性

应用杂交瘤单克隆抗体技术制备了13个分泌抗欧洲鳗免疫球蛋白的单克隆抗体细胞株，并对这些单克隆抗体的特性进行了分析。经抗体级份和亚级份测定，其中IgM有3株，IgG1有5株，IgG2a有3株，IgG2b有2株；所有的单克隆抗体与欧鳗免疫球蛋白均有ELISA反应特性，抗体滴度10^4-10^7，有七株单抗具有WESTERN BLOT反应特性，能在变性条件下识别欧鳗免疫球蛋白的重链。进一步实验证实这些单抗能特异地识别欧洲鳗、日本鳗的免疫球蛋白，而与鲫、淡水白鲳、罗非鱼、胡子鲶、美洲斑点叉尾Hui血清免疫球蛋白以及水产动物常见病原菌如气单胞菌、爱德华氏菌、弧菌、柱状屈桡杆菌、沙门氏菌及大肠杆菌等无任何交叉反应。单克隆抗体9D7，对纯化的欧洲鳗免疫球蛋白的检测灵敏度为16ng。实验结果证明这些单抗具有高度特异、高度灵敏等特点，可用于鳗鲡免疫球蛋白的结构分析、免疫应答水平监测和病原诊断，具有广阔的应用前景。     

嗜水气单胞菌重组β-hemA-ISCOMs对鳗鲡的浸泡免疫效果

嗜水气单胞菌重组β-hemA-ISCOMs对鳗鲡的浸泡免疫效果=Immune effects of the eel after immersed with ISCOMs containing recombinant β-hemA of Aeromonas hydrophila[刊，中]/吴宗福(福建省农业科学院生物技术研究所，福建 福州 350003)，龚晖，陈红燕，杨金先，刘晓东，林天龙//水产学报，－2007，31（3），－374～378 应用嗜水气单胞菌β-hemA重组菌表达产物作为抗原，制备成免疫刺激复合物（β-hemA-ISCOMs），通过浸泡途径免疫鳗鲡，测定免疫鱼细胞和抗体应答水平和免疫效力。试验结果表明：（1）β-hemA-ISCOMs在电镜下呈笼格状颗粒，直径约40 nm；（2）一免后第44天，β-hemA-ISCOMs免疫组淋巴细胞转化率显著高于非β-hemA-ISCOMs免疫组（P<0.05）；（3）免疫浓度在30～120 mg•L-1时，β-hemA-ISCOMs免疫组血清抗体效价与浓度正相关，且显著高于ISM1312佐剂组与无佐剂组（P<0.05）；（4）免疫浓度在30～120 mg•L-1时，β-hemA-ISCOMs免疫组存活率与免疫接种剂量正相关，在同等剂量下，β-hemA-ISCOMs免疫组的存活率高于其它组。因此β-hemA-ISCOMs浸泡免疫可诱导宿主产生细胞与抗体介导的免疫应答，产生保护性免疫，ISCOMs技术适用于制备浸泡型渔用疫苗。图3表4参13