三七总皂甙对大黄鱼肾细胞生长及部分免疫相关基因表达的影响

本试验将三七总皂甙(PNS)体外作用于大黄鱼肾细胞,通过活细胞计数和荧光定量PCR检测,初步了解PNS对大黄鱼肾细胞生长及部分免疫相关因子表达的影响。结果显示,40~200μg/mL浓度的PNS对大黄鱼肾细胞生长无明显影响,但浓度达到1 mg/mL以上时,对细胞生长有负面影响;10~1 000μg/mL浓度的PNS对大黄鱼肾细胞Toll样受体5mRNA的表达有一定的上调作用,但对Toll样受体3的表达有一定的下调作用;PNS浓度为10~100μg/mL时对大黄鱼肾细胞碱性磷酸酶的表达无明显影响,但浓度达到1 000μg/mL时对该因子的表达有下调作用;PNS浓度为10μg/mL时对大黄鱼肾细胞溶菌酶的表达无明显影响,但浓度达到100μg/mL以上时对该因子的表达具有一定的下调作用。     

不同培养条件下欧洲鳗鲡胸鳍传代细胞的生长优势

为建立欧洲鳗鲡病毒性疾病分离、鉴定的细胞模型,以欧洲鳗鲡胸鳍细胞人工培养适应株(第21代)为试验材料,采用人工培养基体外传代培养的方法,探讨欧洲鳗鲡胸鳍传代细胞体外培养的最适条件。观察比较不同培养基(L-15、RPMI-1640、高糖型DMEM)、血清成分(BS和FBS)及其浓度(5%、10%、15%、20%)对欧洲鳗鲡胸鳍细胞生长状态的影响。结果表明:含有10%胎牛血清(FBS)的L-15培养基最适合欧洲鳗鲡胸鳍细胞的生长。     

不同来源嗜水气单胞菌的抗菌素耐药性及耐药机制分析

分离、收集不同时期来源于俄罗斯及国内各地的40株嗜水气单胞菌,常规生理生化鉴定结果表明这些菌株均为嗜水气单胞菌。9种抗菌素药敏纸片对全部菌株的测定结果显示,菌株的耐药强度与原分离地是否使用抗菌素高度相关。质粒与菌株耐药相关性分析结果表明,12个具有1个以上多拷贝质粒的菌株中,有11株呈现高度耐药性,提示耐药性与多拷贝质粒存在相关性;但无质粒或仅有低拷贝质粒的菌株,其耐药性强弱与质粒无相关性。菌株耐药稳定性试验结果证明,4℃条件下长时间保存会降低菌株的抗性,而连续多次冻存、复苏传代对菌株的抗性无影响。     

刺激隐核虫幼虫膜蛋白单克隆抗体的制备与特性分析

为获得刺激隐核虫幼虫膜蛋白单克隆抗体并初步分析单抗特性,提取刺激隐核虫幼虫膜蛋白,免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/O细胞融合,以间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞。通过ELISA方法检测单克隆抗体的亚类及效价;通过SDS-PAGE和western blot分析单抗特异性结合的蛋白,并以串联质谱方法对所识别条带进行鉴定;采用免疫荧光法分析单抗的抗原结合位点和特异性。结果得到3株能稳定分泌刺激隐核虫幼虫膜蛋白抗体的细胞株(5D11AG5、5H9BG3、6E11CE7)。这3株细胞株产生的抗体亚型均为IgM,ELISA效价分别为1∶3200、1∶25600、1∶51200。单抗5D11AG5和单抗5H9BG3株能够识别~35kDa的刺激隐核虫幼虫膜蛋白线性抗原表位,单抗5D11AG5所识别的蛋白与数据库中刺激隐核虫表面抗原蛋白、嗜热四膜虫微管蛋白(tubulin)的肽段具有较高覆盖率。免疫荧光结果显示单抗5D11AG5和单抗5H9DG3识别部位主要在虫体表面近胞口的前端,而单抗6E11CE7识别虫体表面外膜。刺激隐核虫幼虫膜蛋白单克隆抗体的制备,为刺激隐核虫功能性蛋白的筛选、纯化和功能分析提供了条件。     

大黄鱼肿大细胞病毒不同毒株的细胞培养及主要衣壳蛋白基因比较

为建立大黄鱼肿大细胞病毒的培养方法,明确其分类地位,用肿大细胞病毒检测呈阳性的大黄鱼幼鱼病料 (FD201807和SA201808)肾组织匀浆液感染鳜仔鱼细胞系 (mandarin fish fry cell line-1,MFF-1)并连续传代,从病料组织匀浆液和细胞冻融液中提取病毒DNA,克隆病毒主要衣壳蛋白基因 (mcp),测序后与NCBI GenBank中的虹彩病毒科肿大细胞病毒属病毒mcp以及2018—2020年所检出的15株大黄鱼肿大细胞病毒mcp进行比对分析。结果显示,病毒传至第4代才可引起MFF-1细胞病变,细胞病变的主要特征为细胞脱壁、变圆、折光度增强;感染时间越长脱壁细胞越多,同时培养液中的颗粒增加;透射电镜下可见感染细胞的细胞质散在大小为130~150 nm的六边形病毒粒子和空壳。感染细胞的病变周期随传代代次的增加而缩短,第15代次的FD201807株感染细胞80%细胞病变的时间为3 d,第15代次的SA201808株感染细胞80%细胞病变的时间为7~8 d。mcp序列比对和聚类分析发现,SA201808株与FD201807株的mcp序列存在21个碱基差异,二者的mcp序列分别与大黄鱼虹彩病毒(large yellow croaker iridovirus, LYCIV) LYCIV-Zhoushan (GenBank: MW139932.1)和花鲈虹彩病毒 (Lateolabrax maculatus iridovirus, LMIV) (GenBank: MH577517.1)相近。15株从大黄鱼病料检出的肿大细胞病毒中,12株的mcp序列与SA201808株聚类;3株与FD201807聚类。本研究利用MFF-1细胞系分离培养了大黄鱼肿大细胞病毒,揭示了大黄鱼肿大细胞病毒存在差异,为更好地了解大黄鱼肿大细胞病毒提供了数据参考。     

中华鳖虹彩病毒的纯化及分析

为制备高纯度的中华鳖虹彩病毒,分析其免疫相关抗原,采用3种方法纯化中华鳖虹彩病毒粒子并对其结构蛋白进行了初步分析.结果表明:差速离心法回收的样品中病毒纯度差、密度低,在电镜下不易观察到病毒粒子;病毒培养物经冻融、磁力搅拌、超声处理后,进行差速离心可提高病毒的回收率,但超声处理易造成病毒结构破坏;病毒培养物经离心浓缩、匀浆、磁力搅拌处理,再通过差速和蔗糖密度梯度二步离心纯化后,在蔗糖密度为30%～40%、40%～50%和50%～60%之间分层的样品中均可观察到病毒粒子,其中,蔗糖密度为50%～60%之间回收的病毒粒子纯度最高,且结构完好.SDSPAGE分析表明,纯化病毒至少含20条蛋白条带,分子量为50kDa的核衣壳蛋白是中华鳖虹彩病毒的高丰度蛋白.Western-blot分析结果证实大多数蛋白条带能被鼠抗中华鳖虹彩病毒高免血清特异性地识别.     

中华鳖虹彩病毒单克隆抗体的制备及其抗原表位的初步分析

以纯化的中华鳖虹彩病毒为抗原免疫Balb/C小鼠，取免疫鼠脾细胞经杂交融合获得了8个能稳定分泌抗中华鳖虹彩病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。单克隆抗体亚级份分析结果表明，Mab2A4属IgA，Mab8E1是IgG2a，其他的6株单抗Mab1D3、Mab2H1、Mab3A1、Mab4B5、Mab5E1和Mab6F2均为IgG1。酶联免疫吸附剂测定（ELISA）分析表明，8株单抗均能特异性地识别中华鳖虹彩病毒，与EPC、CO、FHM等宿主细胞不产生交叉反应，腹水抗体的ELISA效价在10⁵～10⁶。IFA分析表明，8株单抗中仅Mab5E1没有免疫荧光反应特性，其余7株单抗均能对染毒病灶产生特异性的荧光染色。中和试验结果证实8株单抗均没有中和病毒的特性。应用Western-blotting进行中华鳖虹彩病毒的抗原表位初步分析，结果显示：Mab1D3和Mab2A4分别识别分子量为84 ku和35 ku中华鳖虹彩病毒结构蛋白，Mab3A1能够同时识别分子量分别为14 ku和16 ku的两条多肽，说明这3株单抗结合位点是非构象依赖性抗原决定簇，其余单抗不具备Western-blotting反应特性。这些结果提示上述单抗对中华鳖虹彩病毒抗原特异、灵敏，可用于中华鳖虹彩病毒的检测和结构蛋白分析。     

bFGF和IGF-1细胞生长因子对欧洲鳗鲡胸鳍传代细胞生长的影响

为建立一种欧洲鳗鲡病毒性疾病分离、鉴定的细胞模型,深入了解鳗鲡病毒性疾病流行与传播的情况,本试验在欧洲鳗鲡胸鳍传代细胞体外培养的最适条件下,通过添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)等可能的传代细胞促长因子,并在限定的时间内收集细胞、进行细胞计数、绘制胸鳍细胞的生长曲线,分析其对欧洲鳗鲡胸鳍细胞生长速率的影响。试验结果提示:在10%FBS L-15全价培养基的条件下,bFGF对欧洲胸鳍细胞的生长有明显的促进作用,最佳效应浓度为10μ.L-1;IGF-1(5～50μg.L-1)不利于欧洲鳗鲡胸鳍细胞的生长。     

大黄鱼肾脏组织细胞系(YCK)的建立

大黄鱼Larimichthyscrocea是福建省最重要的经济性鱼类之一。为扩充完善大黄鱼体细胞库,丰富其病毒学、细胞毒理学及细胞工程学研究手段,以大黄鱼肾脏组织为材料,进行组织细胞体外培养条件的探索,构建大黄鱼体细胞体外培养技术体系,并在此基础上建立大黄鱼肾组织细胞系(YCK)。原代培养使用组织块贴壁翻瓶法,标准传代培养是以0.25%胰蛋白酶消化细胞,使用添加10%胎牛血清(FBS)的M-199,在27℃下进行密闭培养,每72h完全换液1次。该细胞系主要由上皮样细胞构成,在上述培养条件下生长旺盛,经过400多天的连续培养,已经成功传代超过70次,第65代YCK细胞的群体倍增时间为36.12h。对常用的鱼类细胞培养基进行适应性筛选,确认M-199是最适合该细胞系的培养介质,也可适用于其他大黄鱼细胞的培养。对该细胞系的染色体分析表明:虽然出现了异倍化现象,但该系依然符合2n=48的二倍体细胞系。