bFGF和IGF-1细胞生长因子对欧洲鳗鲡胸鳍传代细胞生长的影响

为建立一种欧洲鳗鲡病毒性疾病分离、鉴定的细胞模型,深入了解鳗鲡病毒性疾病流行与传播的情况,本试验在欧洲鳗鲡胸鳍传代细胞体外培养的最适条件下,通过添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)等可能的传代细胞促长因子,并在限定的时间内收集细胞、进行细胞计数、绘制胸鳍细胞的生长曲线,分析其对欧洲鳗鲡胸鳍细胞生长速率的影响。试验结果提示:在10%FBS L-15全价培养基的条件下,bFGF对欧洲胸鳍细胞的生长有明显的促进作用,最佳效应浓度为10μ.L-1;IGF-1(5～50μg.L-1)不利于欧洲鳗鲡胸鳍细胞的生长。     

血清浓度对鸡胚盲肠上皮细胞原代培养的影响

为探讨细胞培养基中血清浓度对鸡盲肠上皮细胞体外培养的影响,分别用含0%、2.5%、5%和10%胎牛血清(FBS)的细胞培养液培养鸡胚盲肠上皮细胞,检测细胞活性;选择适宜的FBS浓度,并测定了该浓度条件下鸡盲肠上皮细胞的生长特性。结果表明:用含2.5%和5%FBS的培养基培养鸡胚盲肠上皮细胞,第4天细胞贴壁率达最高,分别为84%和80.33%,显著地高于无血清和10%FBS组(P<0.01/0.05),第7天仍均维持在76%以上,两者间除了第2天外,其余差异均不显著;用含2.5%FBS的细胞培养基进行鸡胚盲肠上皮细胞原代培养,第2~3天为适应阶段,第3~5天处于对数生长期,第5~9天细胞进入减速期,第10~11天再次进入对数生长期,第11天以后细胞进入衰退期,整个过程持续14 d左右。鸡胚盲肠上皮细胞培养的血清浓度以2.5%FBS为宜。     

牦牛成纤维细胞的体外培养研究

采用组织块培养法,分别以DMEM(高糖)和DMEM/F12两种合成培养基为基础液,添加15mL·L-1胎牛血清(FBS)为细胞生长液对牦牛耳组织进行原代培养.同时,比较不同冷冻程序对细胞冷冻的影响,探讨牦牛体细胞在体外环境下的生长参数及染色体变化.结果表明,组织块在第6天开始有细胞游离,14天长至单层,两种基础培养基对细胞生长的影响差异不显著(P＞0.05).细胞在-20℃短时间(不超过1h)冷冻效果较好,但平衡时间过长对细胞解冻后生长影响差异极显著(P＜0.01).染色体分析显示,牦牛成纤维细胞在体外条件下生长,不同传代次数(3代和12代)细胞染色体核型稳定,在所得的中期分裂相细胞中,二倍体细胞都在96%以上.可用于体细胞核移植操作和其他研究.     

大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏组织原代培养的研究

应用组织块培养法,研究了大泷六线鱼Hexagrammos otakii鳍、吻端和肾脏细胞在含有体积分数为20％胎牛血清(FBS)的L-15、DMEM和DMEM/F12 3种培养基中的生长情况,以及人碱性成纤维细胞(bFGF)、硫酸软骨素、Ⅰ型胰岛素样(IGF-Ⅰ)3种生长因子对细胞贴壁率和迁出率的影响.结果表明:大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏细胞适宜的体外培养体系为DMEM/F12培养基+20％ FBS,pH为7.2,温度为25℃;在最适培养基中分别添加5.0 ng/mL bFGF、20 μg/mL硫酸软骨素、40 ng/mL IGF-Ⅰ时,3种组织的贴壁率和细胞迁出率均最高;鳍、吻端和肾脏组织分别经培养21、15、18 d后长满单层,主要为成纤维样细胞;采用低渗滴片法制备染色体,3种组织原代细胞的染色体数目为48条.本研究为大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏组织细胞系的构建和生物学特性的研究奠定了基础.     

山羊胎儿成纤维细胞的冷冻保存和体外培养

将胎儿成纤维细胞悬浮于不同的冷冻保护液中 ,在不同的温度下进行冷冻保存试验。结果显示 ,当保护液中含有 90 0 m L / L胎牛血清 (FBS)时 ,- 196℃下保存的山羊胎儿成纤维细胞解冻后的细胞贴壁率高于- 80℃ ,且前者贴壁细胞增殖也较后者快 ,二者间差异显著 ;而在 - 2 0℃条件下只有一小部分细胞能够存活 ,与前两者相比差异极显著 ,说明 - 2 0℃不适合冷冻胎儿细胞。冷冻保护液中含有 10 0 m L / L二甲基亚砜 (DMSO)的保护效果明显好于 5 0 m L / L DMSO,二者间差异显著。用组织块法培养的细胞 ,在两种培养基 DMEM和 M199中添加 10 0 m L / L FBS和 2 mm ol/ L 2 -巯基乙醇 (2 - Me) ,其组织块成活率及细胞生长速度均高于单纯添加 10 0 m L / LFBS,同时证明 DMEM和 M199都能用于胎儿成纤维细胞的体外培养。以 DMEM培养液为基础 ,分别添加 2mm ol/ L 2 - Me,5 m L / L FBS,10 0 m L / L FBS和 2 m mol/ L 2 - Me+10 0 m L / L FBS对山羊胎儿成纤维细胞进行体外培养 ,结果显示 ,细胞在 10 0 m L / L FBS和 2 mm ol/ L 2 - Me+10 0 m L / L FBS培养液中生长迅速 ,两者间无明显差异 ,2 - Me的存在促进了细胞的增殖 ;两者都与添加 2 m mol/ L 2 - Me组存在显著差异 ;添加 2 m mol/ L 2 - Me和 5m L / L FBS相     

不同培养基组分对牛支原体生长的影响

为了解不同培养基组分对牛支原体生长的影响,试验选用3种动物血清和4个厂商的琼脂,按照5%、10%、15%的血清浓度依次制备了9种液体培养基,分别进行了牛支原体生长试验;在此基础上,用4个厂商的琼脂依次制备了4种固体培养基,分别进行了牛支原体生长试验;通过对液体培养基OD值的测定和对固体培养基性能指标评价来判断牛支原体生长状况。结果表明,牛支原体在9种液体培养基中均能生长,且培养至60 h时其OD值达到最大;在添加血清浓度相同的情况下,添加马血清培养基的OD值与添加猪血清或胎牛血清培养基的OD值相比差异显著(P0.05);在添加相同类型血清的情况下,添加猪血清或胎牛血清的各培养基之间的OD值相比差异不显著(P0.05),而添加马血清的各培养基之间的OD值相比,添加量10%和15%与5%相比差异显著(P0.05),而10%与15%相比差异不显著(P0.05)。而固体培养基的指标性能评分分别为9(BD公司)、7(香港某公司)、5(上海某公司)、6分(成都某公司)。说明添加10%马血清的液体培养基最适宜牛支原体生长,固体培养基应在此液体培养基的基础上,添加BD公司的琼脂所制备的固体培养基最适宜牛支原体的生长。     

不同培养基对粪肠球菌基因表达及黏附细胞能力的影响

为探讨粪肠球菌(E.faecalis)N10菌株在血清肉汤培养基和TSB培养基中不同生长时期15种毒力基因mRNA的表达情况及对IPEC-J2细胞黏附能力的影响,采用分光光度计测量N10菌株在血清肉汤培养基和TSB培养基中的OD值,绘制生长曲线,确定生长时期(对数中期、对数后期和稳定期),用RT-PCR方法检测N10菌株中不同基因不同生长时期的mRNA转录水平,然后将不同培养基不同时期的细菌黏附IPEC-J2细胞,平板计数细菌黏附数量。结果显示,血清肉汤培养基培养的细菌浓度低于TSB培养基培养的细菌浓度(P0.01)。在血清肉汤培养基中,仅有fsrC、sprE、gelE和ant基因的最高表达量低于在TSB培养基中的,其他基因的最高表达量均高于在TSB培养基中的。黏附试验中对数中期细菌的黏附数量最多,血清肉汤培养基培养的细菌黏附数量比TSB培养基培养的细菌黏附数量少(P0.05),但比不加血清的肉汤培养基培养的细菌黏附数量多(P0.01)。可见,血清肉汤培养基有利于菌毛相关基因的表达,肉汤培养基中加入血清可促进细菌黏附。     

不同浓度的FBS和hLIF对小鼠原核期受精卵体外发育率的影响

通过在mM16培养液中添加不同浓度的FBS及hLIF,探讨小鼠原核期受精卵的体外培养条件,旨在建立稳定的小鼠原核期受精卵的体外培养系统。实验结果表明:在mM16中添加10%或15%的FBS都可降低胚胎在体外的发育率,其体外囊胚发育率与对照组mM16(未加血清组)差异显著(73.3%对32.6%;73.3%对35.8%);5001、0001、500 IU/ml 3种不同浓度的hLIF都可提高小鼠受精卵体外发育率,三者之间差异不显著,但以添加1 000 IU/ml hLIF组中,桑椹胚/囊胚率及囊胚脱出率为最高。结论:在mM16中添加血清不能有效地支持小鼠受精卵在体外的发育,添加1 000 IU/ml hLIF能够很好地支持小鼠受精卵的体外发育。     

鳗鲡外周血淋巴细胞转化试验培养条件的初步研究

探讨鳗鲡外周血淋巴细胞转化试验的最优条件,为鳗鲡的细胞免疫研究提供方法。通过对培养时间、培养温度、小牛血清和刀豆蛋白A(ConA)浓度4个参数的测定,初步确定了鳗鲡外周血淋巴细胞转化试验四甲基偶氮唑(MTT)法的培养条件。结果表明,在培养时间60 h和68 h,培养温度为18.0℃、24.0℃、30.0℃,RPMI细胞培养液中小牛血清浓度为5%、10%和15%,ConA浓度为0μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL的范围内,淋巴细胞于18.0℃、含10μg/mL ConA和15%小牛血清的营养液中培养68 h后可获得相对最好的淋巴细胞转化效果。     

食蟹猴支持细胞的分离、纯化以及不同血清浓度对其增殖的影响研究

[目的]纯化培养食蟹猴支持细胞,并测定不同血清浓度对细胞增殖的影响。[方法]分离并纯化食蟹猴支持细胞后,分别以5%、10%、15%、20%4种不同血清浓度的培养基对食蟹猴支持细胞进行培养。利用MTT比色法判断支持细胞的增殖情况,从而确定最佳的血清培养浓度。[结果]5%血清浓度的培养基对细胞增殖能力的影响与10%血清浓度的培养基差异不显著,15%与20%的血清浓度的培养基对细胞增殖能力的影响差异不显著,5%、10%与15%、20%的血清浓度的培养基对细胞增殖能力的影响差异极显著。[结论]15%的血清浓度是支持细胞增殖的最佳比例。     

Hepa1-6细胞的最佳培养条件研究

[目的]探索Hepa1-6细胞的最佳培养条件。[方法]以小鼠Hepa1-6肝癌细胞为材料,采用正交试验设计研究RPMI1640和DMEM2种不同培养基及细胞接种密度、血清浓度、双抗浓度、D-Hanks漂洗次数、胰蛋白酶浓度和消化时间6个不同因素对Hepa1-6传代培养的影响;根据细胞在6个时间点的生长状况评分,筛选出Hepa1-6细胞的最佳培养条件。[结果]Hepa1-6细胞在含有20%血清的RPMI-1640培养基,接种密度为4×104个/cm2,100U/ml的双抗浓度,贴壁率在90%以上时,D-Hanks漂洗1次,0.5%胰蛋白酶消化2min,传代效果最好。[结论]通过正交设计筛选,为Hepa1-6细胞体外培养探索出最佳培养条件。     

Hepa1-6细胞的最佳培养条件研究

[目的]探索Hepa1-6细胞的最佳培养条件。[方法]以小鼠Hepa1-6肝癌细胞为材料,采用正交试验设计研究RPMI1640和DMEM2种不同培养基及细胞接种密度、血清浓度、双抗浓度、D-Hanks漂洗次数、胰蛋白酶浓度和消化时间6个不同因素对Hepa1-6传代培养的影响;根据细胞在6个时间点的生长状况评分,筛选出Hepa1-6细胞的最佳培养条件。[结果]Hepa1-6细胞在含有20%血清的RPMI-1640培养基,接种密度为4×104个/cm2,100U/ml的双抗浓度,贴壁率在90%以上时,D-Hanks漂洗1次,0.5%胰蛋白酶消化2min,传代效果最好。[结论]通过正交设计筛选,为Hepa1-6细胞体外培养探索出最佳培养条件。     

花鳗鲡不同组织同工酶研究

[目的]研究花鳗鲡8种同工酶在不同组织中分布的生理意义。[方法]对花鳗鲡7种组织或器官（心脏、肝脏、肌肉、肾脏、鳃、眼、鳍）中8种同工酶的组织特异性,进行分析。[结果]花鳗鲡的EST、MDH、LDH、POD、SDH、SOD、ADH 7种同工酶均具有明显组织特异性。EST在肝脏中活性最强;MDH在心脏、肝脏中染色较深;LDH在心脏和鳍中含量最高;POD在肾脏中活性最强;SOD在肝脏和肌肉中的含量最高;ADH在肝脏中含量最高。[结论]除ME外,花鳗鲡的7中同工酶均具有明显组织特异性,且不同组织中酶的活性大小也有差别。     

奶牛腹腔巨噬细胞的分离与鉴定

以无血清的RPMI-1640培养液灌洗奶牛腹腔,分离获取奶牛腹腔巨噬细胞,在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中培养。采用倒置显微镜观察细胞形态,并通过瑞氏染色计算其纯度。结果表明,采用无血清的RPMI-1640培养液灌洗奶牛腹腔,能够获得较高纯度的巨噬细胞,能为奶牛胞内寄生菌存活机制的研究提供很好的试验材料。     

水貂附红细胞体的体外培养试验

[目的]对水貂附红细胞体进行体外培养试验。[方法]在 RPMI-1640、DMEM、M-199和 HL培养液中添加30%的新生牛血清或水貂血清,在37℃、5% CO2条件下体外培养水貂附红细胞体,每12 h更换1次培养液,补充适量健康水貂红细胞,并进行传代培养。[结果]RPMI-1640和 HL培养液中附红细胞体的感染率和感染强度高于 DMEM和 M-199培养液,在RPMI-1640和 HL培养液中添加30%水貂血清附红细胞体的感染率和感染强度高于添加30%新生牛血清,且 RPMI-1640略高于HL培养液,培养12 h后获得了80%以上的感染率,且体外传代可连续培养23代。[结论]该研究为筛选有效防治水貂附红细胞体的药物及制备诊断抗原与研制疫苗提供了有效的途径。     

欧洲鳗鲡与日本鳗鲡的染色体组型比较

采用ＰＨＡ体内注射法,以肾组织为材料,结合扫描电镜研究,对区洲鳗鲡、日本鳗鲡的染色体组进行了比较,结果是：欧洲鳗鲡２ｎ＝３８,中部着丝点染色体为６对,近中部着丝点染色体为３对,端部着丝点染以体为１０对,染色体总臂数（ＮＦ）为５６,ｔ３染爸体上有随体。日本鳗鲡２ｎ＝３８,中部着丝点染色体数为５对,近中部着丝点染色体为５对,端产着丝点染色体为９对,染色体总臂数（ＮＦ）为５８。对欧洲鳗鲡、日本鳗鲡的染色     

食蟹猴耳部成纤维细胞体外培养体系的初步建立

建立食蟹猴耳部成纤维细胞的体外培养体系,为食蟹猴体细胞核移植、转基因技术及治疗性克隆做准备.通过组织块培养法进行原代培养,成功分离了食蟹猴耳部成纤维细胞;原代培养后用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液消化细胞,用含10%FBS的DMEM对细胞进行培养,细胞在体外传至第25代;用含10%FBS和10%DMSO的DMEM为冷冻液对细胞进行冷冻保存,解冻传代后,细胞形态和生长速度没有明显变化;用细胞技术法绘制细胞的生长曲线显示,符合体外细胞生长规律;用吉姆萨染色法对不同代数细胞的染色体倍性进行分析,二倍体细胞所占比例为80%以上.     

山羊胎儿成纤维细胞转染人t-PA指形区缺失基因及其核移植研究

采用阳离子脂质体法将人t-PA指形区缺失基因乳腺特异性表达载体(pEBT)导入山羊胎儿成纤维细胞,以山羊胎儿成纤维细胞和转染的山羊胎儿成纤维细胞作供体,构建核移植胚,对其体外发育情况进行了研究,比较了2种供体细胞(山羊胎儿成纤维细胞和转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞)及转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞饥饿处理与否对核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,早期核移植胚有荧光蛋白(GFP)的表达;以山羊胎儿成纤维细胞作供体细胞时,核移植胚的桑葚胚率(50.3%)及囊胚率(16.0%)均高于以转人t-PA指形区缺失基因胎儿成纤维细胞为供体时的桑葚胚率(48.4%)和囊胚率(10.9%),但差异不显著(P>0.05);转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞经饥饿处理后,其核移植胚胎的卵裂率(73.6%)与不饥饿时的卵裂率(73.9%)差异不显著;饥饿处理后核移植胚胎的桑葚胚率(48.5%)和囊胚率(11.2%)均高于不饥饿处理的桑葚胚率(39.2%)和囊胚率(9.2%),但差异不显著(P>0.05)。本研究成功地构建了转人t-PA指形区缺失基因的体细胞核移植胚胎,体外囊胚率为11.2%。