泥鳅鳍细胞系的构建及特性分析

采用组织块培养法对泥鳅Misgurnus anguillicaudatus鳍组织细胞进行原代培养,并采用胰蛋白酶消化法传代,目前已传63代。原代培养和早期传代培养所用培养基为DMEM/F12,并添加体积分数为20%的胎牛血清(FBS)、10 ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20 ng/mLⅠ型胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)和10μg/mL硫酸软骨素。30代以后所用培养基为20%FBS-DMEM/F12,在CO2培养箱(5%,25℃)中培养,培养的鳍细胞形态为成纤维细胞样,群体倍增时间为56.85 h,特征染色体数目为50条;细胞经液氮冷冻保存30 d,解冻复苏后,存活率为81.31%±1.46%。病毒敏感性试验结果表明,泥鳅鳍细胞系对鲤春病毒血症病毒(SVCV)敏感,病毒滴度为105.62TCID50/mL,而对鱼类诺达病毒(YGNNV)不敏感。泥鳅鳍细胞系的建立丰富了鱼类细胞系的种类,并为泥鳅毒理学、病毒学的研究提供了科学依据。     

生长因子和激素对大菱鲆细胞生长的影响

研究了不同浓度生长因子、激素和条件培养基对大菱鲆Scophthatmus maximus鳍、鳃和肾组织原代培养细胞生长和增殖的影响。结果表明：当氢化可的松（HC）浓度为0.4μg/mL时,鳍、鳃组织贴壁率和迁出率最高,分别为89.4%、53.3%和92.3%、59.6%,浓度为0.8μg/mL时,肾细胞的增殖量最大;当表皮生长因子（EGF）浓度为10 ng/mL时,鳍、鳃组织块的贴壁率和迁出率均达到最高,分别为85.9%、54.6%和88.1%、56.8%,肾细胞的增殖量最大;当胰岛素（Ins）浓度为5μg/mL时,鳍、鳃组织块的贴壁率和迁出率均达到最高,分别为90.8%、52.3%和92.3%、54.2%,肾细胞的增殖量也达到最大值;当sp2/0条件培养基的添加比例为1/5时,鳍和鳃组织块的贴壁率均达到最高（96.8%和92.8%）,鳃的迁出率最高,为59.3%,肾细胞的增殖量最大;sp2/0条件培养基比例为1/4时,鳍的迁出率最高（52.3%）。     

松江鲈脾组织细胞的短期培养及染色体分析

采用组织块法对体质量为120~140 g的松江鲈Trachidermus fasciatus脾组织细胞进行短期培养并对染色体进行了分析。结果表明:在p H为7.2、温度为25℃的条件下,松江鲈脾组织细胞在含有20%南美胎牛血清(FBS)、人碱性成纤维样细胞生长因子(b FGF)、硫酸软骨素、Ⅰ型胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)的培养基中,生长良好,迁出细胞有悬浮和贴壁两种形式;悬浮细胞为圆形和椭圆形,贴壁细胞呈变形细胞样和成纤维细胞样;利用悬浮细胞进行的染色体分析显示,松江鲈的染色体数2n=40,核型公式为14m+10sm+16t。本研究结果为松江鲈脾组织细胞系的构建奠定了基础,并初步建立了利用短期培养的脾组织细胞制备染色体的方法。     

斑马鱼性腺组织的原代细胞培养技术的建立

[目的]建立斑马鱼卵巢和精巢组织的原代细胞培养技术,获得原代和传代培养细胞单层。[方法]采用组织块贴壁法进行斑马鱼卵巢和精巢组织的原代细胞培养,采用0.25%胰蛋白酶消化法进行传代培养。[结果]斑马鱼性腺组织的原代细胞培养条件为:最适培养基为DMEM/F12(p H 7.0~7.2),培养温度为24℃,在添加20 ng/m L表皮生长因子(EGF)、20 ng/m L碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)、0.5 mmol/Lβ-巯基乙醇和15%胎牛血清时更有利于细胞的存活。其中,卵巢的组织块接种3~4 d后,上皮样细胞首先开始迁出,迁出的上皮样细胞生长5 d后,逐渐凋亡;此后,成纤维样细胞和另一种上皮样细胞开始大量迁出,10 d后可生长汇合成80%的原代细胞单层;可成功传代培养1次,但传代后的上皮样细胞不贴壁,很快死亡,而传代后的成纤维样细胞可贴壁生长,但基本不分裂,健康存活7 d后开始逐渐凋亡。精巢组织接种5 d后,上皮样细胞和成纤维样细胞同时开始迁出,培养16 d后逐渐凋亡,仅得到60%原代培养细胞单层。[结论]初步建立了斑马鱼性腺组织的原代细胞培养条件,并将卵巢组织块迁出的成纤维样细胞成功传代1次。     

石鲽鳍细胞系的建立及三丁基锡对其毒性作用的研究

为建立石鲽鳍细胞系并研究三丁基锡对其毒性作用,根据石鲽鳍组织的特点采用特定酶消化法启动原代培养,并成功传代。试验结果显示,在24℃,培养于含有碱性成纤维样生长因子及20%胎牛血清的DMEM/F12培养液(pH值7.2)中的鳍细胞,生长分裂状态佳,为成纤维样细胞。传代培养后继续保持旺盛的生长分裂速度,可稳定传代。第60代石鲽鳍细胞的群体倍增时间为46.7 h,特征性染色体数目为48条。目前鳍细胞已传至第68代,已成功建立石鲽鳍细胞系。不同浓度三丁基锡处理后结果显示,1～80 ng/mL三丁基锡均可对鳍细胞产生明显的毒性作用,三丁基锡对鳍细胞的48 h-IC50值为39.87 ng/mL。     

四溴联苯醚慢性胁迫对大泷六线鱼生长及抗氧化酶活力的影响

为研究四溴联苯醚(BDE-47)慢性胁迫对大泷六线鱼Hexagrammos otakii的生物毒性效应,通过设置不同浓度的BDE-47探究了其对大泷六线鱼生长及抗氧化酶活力的影响,试验设置空白对照组和DMSO对照组以及5 ng/L(A组)、50 ng/L(B组)、500 ng/L(C组)、5μg/L(D组)、50μg/L(E组)5个BDE-47浓度组。结果表明:在本试验条件下,各组大泷六线鱼的存活率均为100%;BDE-47对大泷六线鱼生长存在剂量-效应关系,随着BDE-47浓度的增大,大泷六线鱼体长和体质量增长受到的影响也增大,尤其是BDE-47浓度在50 ng/L以上时,鱼体质量出现负增长;BDE-47对大泷六线鱼肝脏和肌肉中的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活力有显著影响,随养殖时间的延长,各浓度组肝脏SOD、CAT活力均呈先升高后降低的波动变化趋势;随着养殖时间的延长,高浓度组肌肉CAT活力呈先升高后降低的变化趋势,低浓度组肌肉CAT活力及各浓度组肌肉SOD活力均无明显变化趋势。研究表明,各浓度的BDE-47不同程度地抑制大泷六线鱼生长,其中体质量较体长对BDE-47的响应更敏感;在肝脏组织中,SOD和CAT活力对于污染物的胁迫反应比在肌肉组织中更敏感。     

山羊胎儿成纤维细胞的冷冻保存和体外培养

将胎儿成纤维细胞悬浮于不同的冷冻保护液中 ,在不同的温度下进行冷冻保存试验。结果显示 ,当保护液中含有 90 0 m L / L胎牛血清 (FBS)时 ,- 196℃下保存的山羊胎儿成纤维细胞解冻后的细胞贴壁率高于- 80℃ ,且前者贴壁细胞增殖也较后者快 ,二者间差异显著 ;而在 - 2 0℃条件下只有一小部分细胞能够存活 ,与前两者相比差异极显著 ,说明 - 2 0℃不适合冷冻胎儿细胞。冷冻保护液中含有 10 0 m L / L二甲基亚砜 (DMSO)的保护效果明显好于 5 0 m L / L DMSO,二者间差异显著。用组织块法培养的细胞 ,在两种培养基 DMEM和 M199中添加 10 0 m L / L FBS和 2 mm ol/ L 2 -巯基乙醇 (2 - Me) ,其组织块成活率及细胞生长速度均高于单纯添加 10 0 m L / LFBS,同时证明 DMEM和 M199都能用于胎儿成纤维细胞的体外培养。以 DMEM培养液为基础 ,分别添加 2mm ol/ L 2 - Me,5 m L / L FBS,10 0 m L / L FBS和 2 m mol/ L 2 - Me+10 0 m L / L FBS对山羊胎儿成纤维细胞进行体外培养 ,结果显示 ,细胞在 10 0 m L / L FBS和 2 mm ol/ L 2 - Me+10 0 m L / L FBS培养液中生长迅速 ,两者间无明显差异 ,2 - Me的存在促进了细胞的增殖 ;两者都与添加 2 m mol/ L 2 - Me组存在显著差异 ;添加 2 m mol/ L 2 - Me和 5m L / L FBS相     

牦牛成纤维细胞的体外培养研究

采用组织块培养法,分别以DMEM(高糖)和DMEM/F12两种合成培养基为基础液,添加15mL·L-1胎牛血清(FBS)为细胞生长液对牦牛耳组织进行原代培养.同时,比较不同冷冻程序对细胞冷冻的影响,探讨牦牛体细胞在体外环境下的生长参数及染色体变化.结果表明,组织块在第6天开始有细胞游离,14天长至单层,两种基础培养基对细胞生长的影响差异不显著(P＞0.05).细胞在-20℃短时间(不超过1h)冷冻效果较好,但平衡时间过长对细胞解冻后生长影响差异极显著(P＜0.01).染色体分析显示,牦牛成纤维细胞在体外条件下生长,不同传代次数(3代和12代)细胞染色体核型稳定,在所得的中期分裂相细胞中,二倍体细胞都在96%以上.可用于体细胞核移植操作和其他研究.     

LIF和IGF-1对牛胚胎干细胞分离的影响

比较了添加 L IF,IGF- 1和 L IF+IGF对牛胚胎干细胞 (ES)分离的影响。结果表明 :1添加10 ng/m L L IF能提高胚胎贴壁率 ,促进内细胞团 (ICM)和 ES细胞的增殖并抑制其分化 ;2添加 10 ng/m L IGF- 1既能提高胚胎贴壁率 ,又能使 ICM明显增殖的时间和传代后集落出现的时间提前 ;3添加 10 ng/m L L IF+10 ng/m L IGF- 1,可以同时发挥两种生长因子的作用效果 ,更有利于牛胚胎干细胞的分离。     

Cu~(2+)对栉孔扇贝外套膜组织培养的影响

[目的]了解重金属对栉孔扇贝的毒理效应。[方法]在DMEM培养液中分别添加质量浓度为0.05、0.10、0.20、0.40 mg/L的Cu2+,以细胞迁出时间和组织块增殖状况为评价指标,研究Cu2+对栉孔扇贝外套膜组织培养的影响。[结果]栉孔扇贝外套膜在DMEM培养液中贴壁良好。培养至72 h时,Cu2+质量浓度为0.05 mg/L的实验组有游离细胞迁出,且组织块增殖情况良好。培养至89 h时,Cu2+质量浓度为0.10 mg/L的实验组有游离细胞迁出,且组织块增殖情况较差。随着Cu2+质量浓度的增大,细胞迁出所需的时间越长,组织块增殖情况越差。Cu2+质量浓度为0.40 mg/L的实验组,培养96 h时并没有游离细胞迁出。[结论]Cu2+质量浓度大于0.10 mg/L时对栉孔扇贝外套膜的组织培养有一定的抑制作用。     

GDNF和LIF对小鼠精原干细胞体外增殖的影响

【目的】探讨胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和白血病抑制因子（LIF）对小鼠精原干细胞（SSCs）体外增殖的影响,为后续SSCs的诱导分化、转基因动物生产、基因治疗等研究奠定基础。【方法】收集6～8日龄小鼠睾丸,采用机械法和2步酶消化法获得细胞悬液。通过多次差异贴壁法分离纯化SSCs和支持细胞,采用碱性磷酸酶（AP）染色和RTPCR检测Ngn3和Oct4基因2种方法对SSCs进行鉴定。采用单独添加GDNF（添加量为0,10,20,40 ng/mL）或LIF（添加量为0,500,1 000,1 500 U/mL）的无血清DMEM/F12培养基培养SSCs,于培养第3,5,7天取样,同时用添加GDNF和LIF（各因子单独添加量两两组合）的无血清DMEM/F12培养基培养SSCs,于培养第3,4,5天取样,采用甲基噻唑基四唑（MTT）法检测GDNF、LIF对SSCs体外增殖的单因子效应和配伍效应。【结果】与对照组相比,不论培养时间如何,单独添加20和40 ng/mL的GDNF可以显著促进SSCs增殖(P＜0.05),而单独添加不同量LIF对SSCs增殖的影响不显著(P＞0.05);同时添加20 ng/mL GDNF和1 000 U/mL LIF可以显著促进SSCs的增殖,在该条件下当精原干细胞接种密度为(6×10⁴)～(10×10⁴) mL^-1,共培养5 d时,其OD₄₉₀值为0.696。【结论】DMEM/F12培养基中单独添加20 ng/mL GDNF或同时添加20 ng/mL GDNF 和 1 000 U/mL LIF可以显著促进小鼠SSCs的体外增殖。     

bFGF和IGF-1细胞生长因子对欧洲鳗鲡胸鳍传代细胞生长的影响

为建立一种欧洲鳗鲡病毒性疾病分离、鉴定的细胞模型,深入了解鳗鲡病毒性疾病流行与传播的情况,本试验在欧洲鳗鲡胸鳍传代细胞体外培养的最适条件下,通过添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)等可能的传代细胞促长因子,并在限定的时间内收集细胞、进行细胞计数、绘制胸鳍细胞的生长曲线,分析其对欧洲鳗鲡胸鳍细胞生长速率的影响。试验结果提示:在10%FBS L-15全价培养基的条件下,bFGF对欧洲胸鳍细胞的生长有明显的促进作用,最佳效应浓度为10μ.L-1;IGF-1(5～50μg.L-1)不利于欧洲鳗鲡胸鳍细胞的生长。     

血管内皮生长因子对绵羊卵母细胞体外受精及胚胎发育的影响

为了研究血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对绵羊卵母细胞体外成熟和成熟后卵母细胞体外受精卵的早期发育的影响,在细胞培养过程中分别在体外成熟培养液、体外受精液及体外胚胎发育液中添加5、10 ng/mL VEGF.结果显示,添加VEGF组卵母细胞的体外成熟率由对照组的80.68%提高到了86.09%和85.22%(P<0.01),成熟卵母细胞的卵裂率由69.38%提高到了75.18%和73.48%(P>0.05),5 ng/mL添加组的桑葚胚率(45.45%)和囊胚率(30.06%)极显著(P<0.01)高于对照组(37.61%;23.65%);而10 ng/mL添加组的桑葚胚率(40.25%)和囊胚率(27.80%)低于5 ng/mL添加组的,高于对照组,但差异不显著.据此认为5 ng/mL VEGF的添加量比10 ng/mL VEGF添加量能更有效的促进绵羊卵母细胞体外成熟、体外受精和胚胎早期发育.     

3种基础培养液对昆明小鼠ESC生长的影响

以昆明小鼠的囊胚及胚胎干细胞为材料,用组成成份清楚的培养体系,研究不同的基础培养液(h-DMEM,DMEM/F12,Knockout DMEM)对昆明小鼠胚胎干细胞生长的影响。分别将小鼠囊胚置于以上3种培养液为基础的培养液(M1、M2、M3)中,4 d后观察原代集落形成率;取正常培养较小的胚胎干细胞集落,分别接种在上述培养液中培养观察;单细胞传代并观察结果;以碱性磷酸酶染色及OCT-4免疫荧光染色鉴定。3种基础培养基中原代集落形成率分别为100%,100%,96.3%;Knockout DMEM与DMEM/F12中的胚胎干细胞增殖的速度远快于h-DMEM中的增殖速度;单细胞传代的昆明小鼠胚胎干细胞都能形成集落;经AKP染色和OCT-4免疫荧光染色,证明3种培养体系中的胚胎干细胞均符合胚胎干细胞的特性。Knockout DMEM与DMEM/F12较DMEM更有利于胚胎干细胞的生长。     

山羊转t-PA突变体基因的体细胞核移植研究

比较了用转t-PA突变体基因的胎儿成纤维细胞和卵丘细胞作供体时核移胚的发育情况。结果表明:卵丘细胞作供体时,核移胚的卵裂率(82.9%)和桑葚胚率(55.9%)均高于胎儿成纤维细胞卵裂率(75.7%)和桑葚胚率(48.7%),但差异不显著(P>0.05);卵丘细胞作供体时的囊胚率(19.7%)则高于胎儿成纤维细胞(11.0%),差异显著。(P<0.05)。比较了饥饿处理与否对胎儿成纤维细胞作供体时转基因核移胚的发育情况。结果表明:供体细胞饥饿后,其核移胚的卵裂率(75.6%)与供体不饥饿的卵裂率(75.8%)差异不显著;供体细胞饥饿后,其核移胚的桑葚胚率(46.5%)和囊胚率(11.0%)高于供体不饥饿的桑葚胚率(39.3%)和囊胚率(9.0%),但差异不显著。比较了SOFaa和CR1aa分别添加10?S和bFF后,转基因核移胚的发育情况。结果表明:用CR1aa液培养时,添加10?F,其囊胚率(9.1%)高于添加10?S(4.2%)(P>0.05);用SOF液培养时,添加10?F,其囊胚率(11.2%)高于添加10?S(5.5%)(P>0.05)。说明用SOF液优于CR1aa液。     

胎鼠额叶皮质神经干细胞的分离培养与分化

目的:探索从胚胎小鼠额叶皮质分离培养神经干细胞的方法。方法:无菌条件下分离孕13～15d小鼠胚胎额叶皮质脑组织,经消化及机械吹打成单细胞后接种于含有B27、bFGF的DMEM/F12培养基,培养扩增;倒置显微镜观察比较生长状况;机械分离法传代;10%血清接种分化;免疫细胞化学方法染色鉴定神经干细胞及其子代细胞的分化方向,结果:培养的部分细胞体外分裂增殖,同时表达神经干细胞特异性抗原nestin,并向神经细胞和胶质细胞分化。结论:小鼠胚脑存在具有多分化潜能的神经干细胞,它们能在体外稳定培养、传代和分化,为细胞替代治疗提供了理想的细胞来源。     

IGF-Ⅰ对山羊睾丸间质细胞分泌cAMP和睾酮的影响

利用山羊睾丸间质细胞体外培养的方法,研究ＩＧＦ－Ⅰ对ｃＡＭＰ和睾酮的影响。结果表明：①ＩＧＦ－Ⅰ可使间质细胞外ｃＡＭＰ积聚能力的显著增强（Ｐ＜０．０５～Ｐ＜０．００５）。②ＩＧＦ－Ⅰ可使间质细胞分泌睾酮的能力显著增加（Ｐ＜０．０５～Ｐ＜０．０１）。③ＩＧＦ－Ⅰ可刺激山羊间质细胞经ｈＣＧ诱导睾酮分泌的显著增多（Ｐ＜０．０５～Ｐ＜０．０１）。以上结果与催乳素和白细胞介素－ｌα这些含氮激素（因子）调节睾酮分泌的机理不同。