泥鳅鳍细胞系的构建及特性分析

采用组织块培养法对泥鳅Misgurnus anguillicaudatus鳍组织细胞进行原代培养,并采用胰蛋白酶消化法传代,目前已传63代。原代培养和早期传代培养所用培养基为DMEM/F12,并添加体积分数为20%的胎牛血清(FBS)、10 ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20 ng/mLⅠ型胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)和10μg/mL硫酸软骨素。30代以后所用培养基为20%FBS-DMEM/F12,在CO2培养箱(5%,25℃)中培养,培养的鳍细胞形态为成纤维细胞样,群体倍增时间为56.85 h,特征染色体数目为50条;细胞经液氮冷冻保存30 d,解冻复苏后,存活率为81.31%±1.46%。病毒敏感性试验结果表明,泥鳅鳍细胞系对鲤春病毒血症病毒(SVCV)敏感,病毒滴度为105.62TCID50/mL,而对鱼类诺达病毒(YGNNV)不敏感。泥鳅鳍细胞系的建立丰富了鱼类细胞系的种类,并为泥鳅毒理学、病毒学的研究提供了科学依据。     

大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏组织原代培养的研究

应用组织块培养法,研究了大泷六线鱼Hexagrammos otakii鳍、吻端和肾脏细胞在含有体积分数为20％胎牛血清(FBS)的L-15、DMEM和DMEM/F12 3种培养基中的生长情况,以及人碱性成纤维细胞(bFGF)、硫酸软骨素、Ⅰ型胰岛素样(IGF-Ⅰ)3种生长因子对细胞贴壁率和迁出率的影响.结果表明:大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏细胞适宜的体外培养体系为DMEM/F12培养基+20％ FBS,pH为7.2,温度为25℃;在最适培养基中分别添加5.0 ng/mL bFGF、20 μg/mL硫酸软骨素、40 ng/mL IGF-Ⅰ时,3种组织的贴壁率和细胞迁出率均最高;鳍、吻端和肾脏组织分别经培养21、15、18 d后长满单层,主要为成纤维样细胞;采用低渗滴片法制备染色体,3种组织原代细胞的染色体数目为48条.本研究为大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏组织细胞系的构建和生物学特性的研究奠定了基础.     

药用植物草麻黄细胞的悬浮培养

[目的]对草麻黄的子叶诱导出的愈伤组织,进行悬浮培养。[方法]采用组织培养的方法进行了愈伤组织诱导、愈伤组织继代和悬浮培养研究。[结果]MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA为诱导子叶形成愈伤组织的理想培养基;MS+1.5 mg/L 2,4-D+1.5 mg/L6-BA是愈伤组织的适宜继代培养基;2.0 mg/L 2,4-D+1.5 mg/L 6-BA+300 mg/L水解酪蛋白(CH)是愈伤组织悬浮培养的适宜培养基,愈伤组织干重增加量为0.80 g。[结论]初步选择出草麻黄愈伤组织细胞的悬浮培养条件,为麻黄细胞扩大培养及有效成分提取奠定基础。     

药用植物灵菊七愈伤组织诱导及其染色体数目稳定性研究

研究了不同植物激素对药用植物灵菊七愈伤组织诱导、继代培养、细胞染色体稳定性的影响。结果表明,灵菊七的愈伤组织诱导、继代培养分别以MS+4.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA、MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA为培养基较适宜。培养在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA上的愈伤组织细胞中期分裂相染色体数目稳定,为20条,而培养在MS+2.0 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA上的愈伤组织细胞中期分裂相染色体数目不稳定,其中86.7%的细胞含有20条染色体,13.3%的细胞含有10条染色体,表明激素ZT会导致愈伤组织细胞的染色体数目不稳定。在81个被观察的愈伤组织细胞中,超过85%的细胞染色体数目为20,表明灵菊七的体细胞染色体数应为2 n=20。     

CD20片段抗体在红花悬浮细胞中的表达研究

【目的】研究用红花愈伤组织建立红花悬浮细胞培养体系的条件,并利用红花悬浮细胞通过农杆菌介导转化法表达CD20复合片段抗体。【方法】以红花子叶为外植体,研究不同种类激素组合对愈伤诱导率的影响,筛选优质愈伤组织进行悬浮培养,探索不同初始接种量、蔗糖质量分数、水解酪蛋白质量浓度对红花悬浮细胞生长的影响。将CD20复合片段抗体基因两端引入XmaⅠ/EcoRⅠ酶切位点,并将其与pEASY-T1和pBasta载体相连,构建pEASY-T1-CD20克隆载体和pBasta-CD20表达载体,再将构建的pBasta-CD20表达载体转入根瘤农杆菌,利用根瘤农杆菌介导红花悬浮细胞转化法表达CD20复合片段抗体。【结果】红花子叶愈伤诱导最佳条件为MS+NAA 2mg/L+6-BA 0.5mg/L、温度(25±0.1)℃、光照70μmol/(m2·s)连续光照,继代培养条件为MS+NAA 1mg/L+6-BA 0.5mg/L、30μmol/(m2·s)连续光照、温度(25±0.1)℃。悬浮细胞体系培养最佳条件为不加琼脂粉的MS+NAA 1mg/L+6-BA 0.5mg/L、接种量2.5g(50mL培养基)、蔗糖质量分数2%、水解酪蛋白800mg/L。pBastaCD20表达载体构建成功,且目的蛋白在红花悬浮细胞中成功表达。【结论】成功构建了红花悬浮细胞培养体系,并用该体系成功表达了CD20复合片段抗体。     

曼地亚红豆杉细胞悬浮培养体系的建立

【目的】建立曼地亚红豆杉的愈伤组织细胞悬浮培养体系,为紫杉醇生产提供参考。【方法】以曼地亚红豆杉幼茎诱导的愈伤组织为材料,以B5培养基为基本培养基,利用单因素试验或正交试验,研究愈伤组织接种量、蔗糖质量浓度、激素类型及配比和防褐化试剂对曼地亚红豆杉细胞生长的影响。【结果】曼地亚红豆杉细胞悬浮培养的最佳培养基和培养条件为:B5+2,4-D 0.6mg/L+NAA 0.8mg/L+KT 1.0mg/L+柠檬酸220mg/L+PVP350mg/L+水解乳蛋白450mg/L+蔗糖30g/L(pH=5.8),接种量0.1g/mL,在培养箱中110r/min、25℃暗培养。【结论】曼地亚红豆杉愈伤组织细胞在所建立的培养体系中经过多次继代后,生长状况良好,表明该细胞悬浮体系比较稳定,可以用于大规模培养红豆杉细胞。     

豆腐柴愈伤组织诱导及细胞悬浮培养

为探究适宜豆腐柴(Premna microphylla Turcz)细胞悬浮培养条件,以豆腐柴叶片为材料,进行了愈伤组织的诱导、继代培养、愈伤组织分散、悬浮培养的研究,建立了摇瓶悬浮培养体系。结果表明,豆腐柴叶片诱导得到的愈伤组织形态各异,其中诱导最适合悬浮培养的松散型胚性愈伤组织的培养基为MS+0.4 mg/L 2,4-D+0.4 mg/L NAA+3%蔗糖+0.8%琼脂。通过纤维素酶和果胶酶分散愈伤组织块可以得到较好的分散细胞系,最适合悬浮细胞生长的培养基条件为MS+0.4 mg/L 2,4-D+0.8 mg/L KT+3%蔗糖,其悬浮培养细胞鲜重增加量平均每7 d可达6.46倍,暗培养相对更适合细胞的增殖。经最佳培养条件下培养21 d的豆腐柴悬浮细胞中果胶和蛋白质平均含量达6.57%和0.12%,远低于豆腐柴天然叶片中的含量。     

丰花月季愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养

分别以丰花月季叶片、叶柄和茎段为外植体诱导出愈伤组织,并建立细胞悬浮系。结果表明,丰花月季叶片和茎段是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的理想外植体;诱导松散型愈伤组织的最佳激素浓度配比是NAA 4 mg·L-1+2,4-D 1 mg.L-1+BA 1 mg.L-1;细胞悬浮培养细胞最佳起始密度为1.5×104～3.0×104个.mL-1时;继代培养4～5代时,可得到稳定的悬浮细胞系。     

黑龙江茴鱼(Thymallus arcticus grubei Dybowski)的细胞遗传学分析

采用体内注射PHA和秋水仙素,肾细胞短期培养,常规空气干燥法制备黑龙江茴鱼(Thymallus arcticus grubei Dybowski)的染色体.对其肾细胞染色体数目统计分析表明,黑龙江茴鱼染色体组有92条染色体,核型公式为2n=36m+10sm+8st+38t,其染色体总臂数(NF)为138.采用流式细胞分...     

太行菊细胞悬浮培养体系的建立

以太行菊(Opisthopappus taihangensis)作为试材,进行了细胞悬浮培养的初步探讨.结果表明,试管苗茎段诱导愈伤组织最适培养基配方为MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+2,4-D 1.0 mg·L-1,诱导出的愈伤组织生长迅速,且排列紧密质地松软适合进行细胞悬浮培养....     

福寿螺组织细胞原代培养及染色体核型分析

无菌分离取得福寿螺肌肉、外套膜、肾脏及脑组织,分别采用胰酶消化法和研磨法进行组织细胞分离,选取DMEM、F12和改良1640培养基分别进行细胞原代培养,光镜下观察细胞的生长状态,MTT法测定细胞活性。细胞培养一定时间后进行染色体制备及染色体核型分析。结果表明,福寿螺组织细胞在不同的培养基培养下活力具有明显差异,用含水解乳蛋白的DMEM培养基培养的福寿螺外套膜和斧足组织细胞活力较好;用M199培养基培养的福寿螺斧外套膜和脑组织细胞活力较好。核型分析结果表明福寿螺染色体为二倍体(2n=28,NF=56),核型为2B型,核型不对称系数为66.4%。     

天然二倍体和四倍体泥鳅鳍细胞系染色体组构成研究

对传代20次的天然二倍体和天然四倍体泥鳅鳍细胞系进行染色体标本制备,并对其染色体核型、Ag-NORs及CMA3/DA/DAPI三重荧光染色等进行研究。结果显示,1二倍体泥鳅鳍组织培养细胞的染色体数目为2n=50,核型公式为:2n=10m+4sm+36t,NF=64;四倍体泥鳅鳍组织培养细胞的染色体数目为4n=100,核型公式为:4n=20m+8sm+72t,NF=128。2天然二倍体泥鳅鳍培养的细胞中期染色体分裂相有2个Ag-NORs,天然四倍体泥鳅鳍培养的细胞中期染色体分裂相有4个Ag-NORs,均位于第1对中部着丝粒染色体(M1)的末端。3天然二倍体泥鳅鳍培养的细胞染色体中期分裂相中CMA3阳性位点为2个,天然四倍体泥鳅鳍培养的细胞染色体中期分裂相中CMA3阳性位点为4个;均位于核仁组织区,即第1对中部着丝粒染色体(M1)的末端。结果表明,天然二倍体和四倍体泥鳅鳍培养细胞制备的染色体数目、核型和带型与体细胞一致。     

真菌诱导子对白术悬浮细胞生长与次生代谢的影响

为探讨不同真菌诱导子对白术悬浮细胞生长和次生代谢的影响，于无菌状态下培养白术无菌苗，诱导愈伤组织，并构建悬浮细胞培养体系，记录悬浮细胞干质量，绘制生长曲线，添加不同内生真菌诱导子溶液后共培养，用高效液相色谱法测定悬浮细胞中白术内酯Ⅰ、白术内脂Ⅲ与苍术酮含量。结果表明，MS+6-BA(6-苄氨基嘌呤)1.0 mg/L+NAA(1-萘乙酸)0.5 mg/L是白术愈伤组织诱导的最适培养基，MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L是悬浮细胞增殖的最适培养基；白术悬浮细胞生长呈现S形曲线生长特征，对数生长期培养体系pH值稳定在4.8～5.0；真菌诱导子显著影响悬浮细胞生长与次生代谢，其中AM478真菌诱导子和AM393真菌诱导子对悬浮细胞生长具有显著促进作用，AM569真菌诱导子对白术内酯Ⅲ与苍术酮积累具有显著促进作用。综上，筛选得到的AM569菌诱导子可作为白术悬浮细胞生物转化的备选诱导子，以促进白术有效成分积累。     

南方鲇肾细胞系(SMK-Ⅰ)的建立及其细胞骨架的研究

南方鲇肾细胞系(SMK-Ⅰ)在培养初期为成纤维样和上皮样细胞的混合细胞系, 随着传代次数的增加, 形成了稳定的成纤维型细胞系; SMK-Ⅰ细胞的生长周期为7～8天; 大多数细胞的染色体为二倍性, 也观察到染色体多倍化和异倍化的细胞群体; 流式细胞仪分析不同代龄的细胞周期, 发现该细胞系G2-M期细胞的数量, 随着代龄的增加, 逐渐增多, 说明该细胞系已经成功转化; Pena法显示其细胞骨架网络比较分散, 且随细胞贴壁的情况和本身的形态而异.     

海巴戟天愈伤组织诱导及细胞悬浮培养试验

以海巴戟天叶脉作为外植体,在B5 培养基上诱导出淡黄色、疏松愈伤组织,通过增殖后接种到液体培 养基中,建立细胞悬浮培养体系,并对影响细胞悬浮培养的培养基种类、接种量、pH 值、蔗糖含量等因素进行了研 究。结果表明院B5 + 1 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L 6-BA 能诱导出淡黄色、质地疏松的愈伤组织;较佳愈伤组织增殖培养 基为B5 + 2 mg/L NAA + 0.2 mg/L KT;细胞在B5 + 2 mg/L NAA + 0.2 mg/L KT 培养基中悬浮培养,接种量60 g/L（细 胞鲜重）、蔗糖4%、pH 值5.8、100 r/min、27益下暗培养,海巴戟天悬浮细胞比生长速率为0.0836 d-1,总蒽醌含量 367.8 mg/L,培养周期27~30 d。     

毛泡桐悬浮细胞培养及其植株再生

先将毛泡桐叶片在MS,WPM,KM_8P和B_5等液体基本培养基中进行悬浮培养,然后建立毛泡桐叶片悬浮细胞培养及其体外植株再生体系.结果表明,毛泡桐叶片愈伤组织悬浮诱导最适培养基为改良MS+0.2 mg·L~(-1) NAA+8 mg·L~(-1)BA;细胞悬浮培养的最佳起始密度为6.67×10~6个·mL~(-1);悬浮愈伤组织芽诱导和根诱导的最适培养基分别为MS+0.3 mg·L~(-1)NAA+17 mg·L~(-1)BA和1/2MS+0.1 mg·L~(-1)NAA.     

云南铁壳麦D染色体组的研究

进行了中东节节麦、中国河南节节麦同云南铁壳麦间杂交,对它们间的杂种F_1进行了染色体组分析。中东节节麦×云南铁壳麦的染色体构型为:14.14Ⅰ+5.32Ⅱ环+1.52Ⅱ棒,87.04％的细胞具14Ⅰ+7Ⅱ;中国河南节节麦×云南铁壳麦的染色体构型为:14.06Ⅰ+5.29Ⅱ环+1.69Ⅱ棒,97.05％的细胞具14Ⅰ+7Ⅱ。结果表明,云南铁壳麦的D染色体组较原始。     

喜树细胞悬浮培养体系的建立

以喜树的幼嫩叶片为材料,探讨了MS、SH、B5基本培养基和不同激素(2,4-D、NAA、6-BA)配比对愈伤组织诱导及继代培养的影响,并筛选喜树细胞悬浮培养体系的最优培养基配方.结果表明,喜树幼嫩叶片外植体诱导愈伤培养以SH+2.0mg/LNAA+0.5mg/L6-BA为最优,愈伤组织诱导率为92%.继代培养以MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA为最适,在此条件下诱导的愈伤组织质地疏松,适于进行悬浮培养.     

厚颌鲂核型分析与DNA含量的测定

为了解厚颌鲂(Megalobrama pellegrini)的细胞遗传学特征,分析了厚颌鲂的染色体核型并对其DNA含量进行了测定。采用PHA和秋水仙素活体注射、肾细胞短期培养和空气干燥制片法,经Giemsa染色,对厚颌鲂染色体数目和核型进行研究,结果表明:厚颌鲂2n=48,染色体核型公式为24m+20sm+4st,臂数NF=92,具有1对特大染色体,未发现性染色体。以厚颌鲂外周血细胞为样本,鸡血细胞DNA为标准(2.30pg),使用流式细胞仪测定了厚颌鲂二倍体细胞的DNA含量,厚颌鲂DNA含量为鸡血的1.23倍,绝对含量为2.82pg。     

黑暗培养条件下甘薯悬浮细胞黄酮类物质积累的初步研究

    为了研究甘薯悬浮培养细胞黄酮类物质的积累,利用甘薯块根诱导愈伤组织,在黑暗条件下建立悬浮细胞培养体系,通过测定细胞密度和黄酮类物质含量来确定甘薯悬浮细胞的培养条件.结果表明,甘薯悬浮细胞黄酮类物质的含量同甘薯的块根(0.69%,干重)相当,各种培养条件下的平均值为0.64%;理论最佳培养条件为:用添加2.0 mg·L-1 2,4-D的固体MS培养基诱导愈伤组织,经多次继代培养后,在接种量为2 g·20 mL-1、2,4-D为2.0 mL-1的液体培养基中进行摇悬浮培养,其悬浮细胞黄酮类物质的含量达到0.79%.