兔耳廓软骨的体外培养及细胞特性研究

[目的]研究软骨发育与重建,建立软骨体外培养模式,[方法]通过改良组织块细胞培养法,进行家兔耳廓弹性软骨细胞的体外培养,研究其形态与生长特性。[结果]兔耳软骨组织16 h完成贴壁,1.5 d软骨细胞迁出,144 h细胞生长达到融合;传代兔耳软骨细胞12 h贴壁,生长特性与原代相似,但第3代细胞的延滞期长,在培养48 h开始进入对数期,培养第8天细胞数量达到峰值。HE染色结果表明弹性软骨细胞形态均匀,细胞呈圆形或椭圆形,核呈椭圆形,可见双核或多核现象。软骨陷窝和核深染,胞浆着色均匀。细胞分裂旺盛。同族细胞群清晰。[结论]原代及2代耳软骨细胞体外生长特性及细胞形态一致,培养条件稳定。     

寿光黑鸡成纤维细胞的体外培养与冷冻保存

[目的]建立鸡成纤维细胞的体外培养体系。[方法]用组织块法和消化法分别分离培养鸡皮肤成纤维细胞;比较细胞生长速率及冻存复苏率。[结果]酶消化培养的成纤维细胞原代生长较快,约5 d便可形成单层;2种方法传代细胞的生长速度相似,仅需2~3 d就可形成单层;使用酶消化法和反复贴壁法,经3~4代后,可获得纯化的成纤维细胞;成纤维细胞经冷冻复苏后有75%~80%存活;分离纯化的胚胎和皮肤成纤维细胞的生长曲线均正常,可传至12代,传代后染色体数目不变。[结论]采用组织块法及酶消化法培养鸡成纤维细胞均可获得ES细胞建系所需的饲养层细胞。该研究为ES细胞系的成功建立奠定了基础。     

体外培养山羊成纤维细胞系方法的建立

用山羊组织块和0.25%的胰蛋白酶消化培养法获得正常传代细胞,对于出现的上皮样细胞和成纤维样细胞混合生长的问题,则根据两者贴壁紧实程度不同,用0.05%的胰酶-EDTA进行不同时间的消化,将其分离纯化。纯化的成纤维体细胞经数次传代培养后,进行冷冻解冻检验表明仍具有正常的传代能力。各代体细胞的核型分析表明,在体外培养至20~30代成纤维细胞的细胞形态(为梭形细胞,高度汇合后呈火焰状)、细胞周期以及核型均为正常,符合体细胞克隆转基因的基本要求。     

脂质体介导外源基因体外转染牦牛乳腺上皮细胞条件的优化(英文)

[目的]优化脂质体介导外源基因体外转染牦牛乳腺上皮细胞的条件。[方法]通过胶原酶消化法和组织块贴壁法,体外分离培养得到牦牛乳腺上皮细胞。采用免疫细胞化学技术检测细胞角蛋白在细胞内的表达。以绿色荧光蛋白为报告基因,通过脂质体介导外源基因转染牦牛乳腺上皮细胞,统计在不同细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间下的转染效率,寻求最佳转染条件。[结果]采用胶原酶消化法,24h内细胞团块贴壁生长,纤维样细胞沿着细胞团块生长,后上皮样细胞爬出。上皮细胞与纤维细胞界限明显,细胞呈椭圆形,排列紧密,岛屿状生长。纯化至5代左右可得到较纯的上皮样细胞。采用组织块贴壁法,6d左右组织块周围出现细胞晕,有少量纤维样细胞生长;8d左右,上皮样细胞长出,并往外不断铺展。在荧光显微镜下观察,试验组细胞角蛋白检测呈阳性,细胞质呈绿色,细胞核复染呈红色。牦牛乳腺上皮细胞在细胞融合度为81%～90%,脂质体的量为1.8μl,脂质体与质粒比例为2∶1,转染时间为4h时,转染效率最高。[结论]该研究可为乳腺生物反应器构建提供试验依据。     

大鼠骨骼肌卫星细胞培养的研究

[目的]探讨在体外条件下骨骼肌卫星细胞纯化、培养、鉴定的方法及确定其生物学特性。[方法]取新生大鼠的小腿肌肉,采用肌组织块和肌细胞培养两种方法。分别用胰蛋白酶对培养中的肌组织块和肌细胞进行消化,采用离心及差速贴壁法纯化,得到更高纯度的大鼠骨骼肌肌卫星细胞,进行体外原代骨骼肌和传代骨骼肌的细胞培养。传至第2代后,用分化培养基诱导分化,观察骨骼肌细胞各个阶段的形态特征并拍照。[结果]此方法分离的细胞成活率较高,体外生长、增殖良好。在分化培养基条件下,细胞分化良好,可融合成肌管。[结论]该实验成功探讨了新生大鼠骨骼肌卫星细胞的分化能力并建立了卫星细胞纯化方法,适用于开展细胞移植和肌组织工程方面的研究。     

大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏组织原代培养的研究

应用组织块培养法,研究了大泷六线鱼Hexagrammos otakii鳍、吻端和肾脏细胞在含有体积分数为20％胎牛血清(FBS)的L-15、DMEM和DMEM/F12 3种培养基中的生长情况,以及人碱性成纤维细胞(bFGF)、硫酸软骨素、Ⅰ型胰岛素样(IGF-Ⅰ)3种生长因子对细胞贴壁率和迁出率的影响.结果表明:大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏细胞适宜的体外培养体系为DMEM/F12培养基+20％ FBS,pH为7.2,温度为25℃;在最适培养基中分别添加5.0 ng/mL bFGF、20 μg/mL硫酸软骨素、40 ng/mL IGF-Ⅰ时,3种组织的贴壁率和细胞迁出率均最高;鳍、吻端和肾脏组织分别经培养21、15、18 d后长满单层,主要为成纤维样细胞;采用低渗滴片法制备染色体,3种组织原代细胞的染色体数目为48条.本研究为大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏组织细胞系的构建和生物学特性的研究奠定了基础.     

镉对体外培养小鼠皮肤细胞存活的影响

研究不同浓度的氯化镉对体外培养的小鼠皮肤细胞存活影响。采用组织块法启动小鼠皮肤细胞的原代培养,胰酶消化法传代培养,利用光镜观察、MTT细胞毒性分析、荧光染色和DNA琼脂糖凝胶电泳等方法研究镉对小鼠皮肤细胞的毒性作用。结果显示,在37℃,含20%胎牛血清的DMEM/F12培养条件下,小鼠皮肤组织原代启动第2天即有细胞迁出,为成纤维样细胞形态,生长分裂旺盛,第6天即可长成汇合的细胞单层,并能稳定连续传代。20~160μmol/L氯化镉可显著降低体外培养的小鼠皮肤细胞的存活率,具有浓度和时间的依赖性。处理24和48 h对肝细胞的半致死率浓度分别为39.81和22.39μmol/L。Cd Cl2处理导致皮肤细胞染色质的凝缩和片段化,诱导细胞凋亡。     

羊鲍精巢显微结构的研究

[目的]为羊鲍的人工繁殖提供理论基础。[方法]应用光镜技术研究羊鲍精巢的显微结构。[结果]羊鲍精巢由外膜及其内的大量生殖小管组成;外膜将生殖腺和肝胰腺分开,其组织结构由外至内依次为单层立方上皮、平滑肌纤维和结缔组织;生殖小管在生殖腺内部纵横交错,大量分枝,将生殖腺分隔成许多小腔,生殖小管内生殖细胞发育呈现区域化特征,成熟度越高的生殖细胞越靠近生殖小管腔的中央,反之则靠近生殖小管壁分布。[结论]羊鲍精巢中生殖细胞的发生及其性腺发育与皱纹盘鲍相类似。     

中华鳖胚胎组织原代细胞培养技术的研究

基于当前市场上中华鳖商业化细胞缺乏,不利于开展其病害防控研究的现状,以中华鳖胚胎为对象,采用组织块原代培养技术,从孵育15～20 d的受精卵中获得适宜的胚胎组织,经抗生素、乙醇消毒,通过无菌条件下将组织块均匀分散贴壁在细胞瓶中,然后于30℃恒温培养箱中贴壁培养4 h后加入无血清M199培养基多次清洗,从而获得了中华鳖胚胎组织原代细胞;在此基础上分别对中华鳖胚胎细胞传代培养条件、冻存与复苏等进行系统性研究,初步确定中华鳖胚胎细胞培养温度为26℃,M199或L-15培养基,血清浓度为15%(体积分数),通常7 d传代1次;二甲亚砜冻存保藏后,细胞复苏生长状况正常。     

猪胎儿成纤维细胞的分离与基因转染

为利用核移植法获取转基因克隆猪提供供体细胞,体外分离培养猪胎儿成纤维细胞并进行了绿色荧光蛋白基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养猪胎儿成纤维细胞,绿色荧光蛋白表达载体以脂质法介导转染猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,利用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达。结果表明,组织块贴壁后9 d可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示荧光蛋白基因整合到细胞基因组中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,为下一步通过核移植方法获得转基因猪提供了基础。     

蓝莓的快速繁殖

[目的]为蓝莓快速繁殖技术的研究提供参考。[方法]通过综述蓝莓快速繁殖中的初代培养、继代培养、复壮培养、生根培养技术分析了蓝莓快速繁殖的技术条件。[结果]初代培养的综合条件为：pH值5.2,121℃下高温灭菌20min,（25±2）℃下培养,空气相对湿度为60%左右,光照强度为2200lx,光照时间为17h/d。初代培养无菌芽苗的茎与叶的继代增殖率均可达10倍以上。BA处理的外植体的增殖率和成苗率均低于ZT处理。0.8mg/LZT处理的离体茎段上不定芽的增殖系数达最大,为45。当细胞分裂素浓度相同时,芽外植体越大,增殖系数越大,芽苗生长越旺盛。液体培养方式更能培育出健壮试管苗。[结论]该研究为蓝莓快速繁殖技术的应用奠定了理论基础。     

翠菊离体培养及再生体系的建立

[目的]建立翠菊离体快速繁殖及再生体系。[方法]以无菌播种获得的翠菊试管苗为外植体,以MS为基本培养基,添加不同浓度的6-BA、KT、NAA,对翠菊试管苗进行扩繁及生根培养试验,研究不同生长调节剂对翠菊继代培养和生根培养的影响,筛选翠菊快繁及再生的最佳培养基。[结果]6-BA浓度对愈伤组织的诱导有显著影响,随着6-BA浓度增高,诱导率显著增高;KT对愈伤组织的诱导率最低。MS＋6-BA 0.5mg/L＋NAA 0.1mg／L是翠菊离体快繁的适宜培养基,分生数为5.67±0.82,愈伤诱导率为（53.33±0.09）％;MS＋6-BA 2.0mg／L＋NAA 0.2mg,／L为最佳的再生体系建立培养基,分生数为6.33±1.03,愈伤诱导率为（83.70±0.04）％。在MS＋NAA0.2mg／L培养基中,试管苗生根率可达98.0％以上,炼苗移栽成活率可达90.0％以上。[结论]该试验建立了翠菊离体快速繁殖及再生体系。     

基因型及基本培养基对玉米成熟胚培养的影响

[目的]筛选出适宜玉米成熟胚组织培养的基因型和基本培养基。[方法]以9个基因型的玉米成熟胚为外植体,研究基因型与基本培养基对成熟胚愈伤组织诱导和继代的影响。[结果]试验中表现较好的基因型依次是853-35、853-209、丹34和81162;对于玉米成熟胚愈伤组织的诱导培养,MS培养基比N6培养基更适宜,而对于玉米成熟胚愈伤组织的继代培养,N6的培养基比MS培养基更适宜。[结论]进一步完善了以玉米成熟胚为外植体的组织培养体系。     

小麦洛夫林10悬浮细胞系培养条件的优化与筛选

[目的]优化和筛选小麦洛夫林10悬浮细胞系培养的条件。[方法]以成熟胚为外植体,探讨了附加不同浓度KT对愈伤组织诱导和继代培养的影响,并通过调整2,4-D、KT和蔗糖的浓度及初始接种量对悬浮细胞系的培养条件进行了优化筛选。[结果]小麦洛夫林10愈伤组织的诱导培养基中不宜加入KT;初始接种量为1.5 g,液体培养基中添加1.00~2.00 mg/L 2,4-D、0.05~0.10 mg/L KT和30.00g/L蔗糖,最有利于小麦洛夫林10悬浮细胞系的稳定。[结论]为以悬浮细胞系为材料深入开展小麦抗病机制的研究奠定了基础。     

条件性诱导转基因斑马鱼卵细胞的凋亡和消融

【目的】构建针对斑马鱼Danio rerio卵细胞的可诱导消融品系,并了解其卵巢组织在条件诱导下的去除规律和特性,为相关领域的应用提供材料基础。【方法】利用Tol2转座系统建立卵细胞特异表达硝基还原酶(Nitroreductase,NTR)的转基因斑马鱼品系;通过定期采样,连续观察、解剖、组织切片等方法研究甲硝唑(Metronidazole,Mtz)对成熟雌鱼外观及卵巢结构的影响;冰冻切片结合TUNEL检测,了解条件性诱导对卵巢细胞凋亡的影响。【结果】获得囊胚细胞具特异荧光标记的转基因鱼,并形成稳定遗传品系。经Mtz诱导,该品系成熟雌鱼卵巢结构逐步退化、萎缩,卵母细胞渐渐消融,提示NTR在卵细胞特异表达;检测发现Mtz可导致卵细胞的凋亡,推测卵巢的组织变化为细胞凋亡所致;撤销Mtz胁迫卵巢可再生并恢复生育功能,说明卵巢的消融过程是可逆的。【结论】获得的转基因斑马鱼可通过条件诱导实现卵巢消融与再生。     

基于间歇浸没式生物反应器的荔浦芋组培快繁体系优化

[目的]优化基于间歇浸没式生物反应器系统(TIBs)的荔浦芋组培快繁体系,为荔浦芋脱毒组培苗的工厂化、自动化生产提供技术支持.[方法]以荔浦芋新品种桂芋2号茎尖分生组织脱毒诱导获得的不定芽为外植体,利用TIBs培养系统筛选出适合组培苗增殖及生根的最佳激素组合,并分析不同继代材料、接种密度及浸没间歇频率对组培苗增殖和生根效果的影响.[结果]利用TIBs培养系统可有效提高荔浦芋组培苗的增殖效果,增殖倍数达28.96倍,约是传统固体培养方法(2.87倍)的10倍,且组培苗的株高和生根数均极显著高于传统固体培养植株(P<0.01).在TIBs培养系统中,含4.00 mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+0.05 mg/L萘乙酸(NAA)的培养基最适合荔浦芋组培苗增殖和生长,其组培苗增殖倍数为32.04倍.当接种材料为第4代荔浦芋继代材料、接种密度为10株/L、浸没间歇频率为5 min/6 h时,最有利于组培苗增殖和生长,增殖倍数均在30.00倍以上,可缩短萌芽时间,组培苗长势良好,且培养基污染率为0.[结论]利用TIBs培养系统对荔浦芋继代材料进行高效快繁具有可行性,可为实现及推动荔浦芋健康种苗繁育的工厂化生产提供技术支持.     

杜仲愈伤组织诱导与继代培养研究

[目的]对杜仲进行愈伤组织诱导及继代培养,建立愈伤组织的培养系统。[方法]以杜仲子叶、幼叶、下胚轴为外植体,接种于不同培养基中诱导和继代。[结果]不同外植体愈伤组织的诱导率高低顺序为：下胚轴〉子叶〉幼叶。子叶和幼叶在MS＋NAA 1.00 mg/L、MS＋2,4-D 1.00 mg/L培养基中诱导出的愈伤组织在MS＋6-BA 1.00 mg/L＋NAA 2.00 mg/L、MS＋2,4-D 1.00 mg/L培养基中继代培养为佳;胚轴在MS＋NAA 3.00 mg/L、MS＋6-BA 1.00 mg/L＋NAA 1.00 mg/L和MS＋2,4-D 1.00 mg/L培养基中诱导出的愈伤组织在MS＋6-BA1.00 mg/L＋NAA 2.00 mg/L、MS＋6-BA 1.00 mg/L＋NAA 1.00 mg/L和MS＋2,4-D 1.00 mg/L培养基中继代培养为佳。[结论]杜仲的子叶、幼叶和胚轴可采用多条途径实现愈伤组织的诱导和继代增殖培养,为进一步筛选高产细胞系打下基础。     

草莓未受精子房的离体培养

[目的]探索适合草莓未受精子房的离体培养条件。[方法]分析草莓基因型、外源激素、蔗糖浓度、低温预处理、生长环境及发育状况、光照条件6个关键因素对诱导雌核发育的影响。[结果]选择合适基因型的露地栽培的一级花蕾,外源激素添加2,4-D,蔗糖浓度6%,低温预处理48h,黑暗变温处理是草莓未受精子房离体培养获得单倍体胚囊植株的理想条件。[结论]本研究为草莓倍性育种提供了参考。     

Improved Isolation and Culture of Embryonic Germ Cells from Guanzhong Dairy Goat

A total of 219 embryonic-germ-cell-like （EG-like） clumps were derived from 15 selected goat fetuses. Isolation of primordial germ cells （PGCs） based on co-culture with primary goat embryonic fibroblast showed no difference from traditional feeder layer-based culture method used in mouse and human. The putative primary EG colonies were multilayer clumps of compact cells with unclear cell-cell boundaries. Three subculture methods of goat EG-like colony, traditional enzymatic digestion, mechanical cutting and combination of the both, were compared in this study. As a result, EG-like colonies traditionally disassociated with collagenase 1V could be subcultured for up to 4 passages. And the mechanically disaggregated EG-like colonies were successfully maintained 9-12 passages with or without enzymatic treatment. The pluripotency of the EG-like colonies was identified by their specific marker staining, spontaneous differentiation and embryoid bodies （EBs） formation in vitro. Most goat EG-like colonies （〉 80%） were AKP positive and immunocytochemically characterized with positive SSEA-1, Oct-4 and c-kit staining but SSEA-4. Under the condition of delaying passage, goat EG-like cells could differentiate into fibroblast-like, epithelium-like, and neuron-like cells. In addition, EBs could be obtained successfully in routine hanging drop culture. The serum free culture system （feeder layer-based） used in this study was suitable for keeping PGCs and EG-like cells in their undifferentiated condition, but failed to converse them to immortal cells. These results indicated that mechanical cutting is an effective method for passaging goat EG cell colonies. However, the microenvironment of conversing EG cells to immortal cells is still unclear.