兔成纤维细胞的分离与体外培养

用Ⅰ型、Ⅳ型胶原酶消化分离兔皮肤细胞,Ⅰ型胶原酶消化皮肤块获得的细胞数显著高于Ⅳ型胶原酶。用组织块直接培养法,也可以得到皮肤的原代培养细胞。２．５ｇ／Ｌ胰酶消化胎儿组织,可获得足够原代培养的细胞量。结合使用酶消化法和反复贴壁法,经２～３代后,可获得纯化的成纤维细胞。分离纯化的胎儿和皮肤成纤维细胞的生长曲线都正常且相似。胎儿和皮肤成纤维细胞可分别传至第１３代与第１１代,传代后染色体数目不变。     

麋鹿耳皮肤成纤维细胞的分离、培养与核型分析

为获得适合于克隆麇鹿的供体细胞,本试验对麋鹿耳皮肤成纤维细胞的分离、培养、纯化、生长特征、核型分析和冷冻保护剂等进行了研究。通过组织块培养法获得麋鹿皮肤成纤维细胞,用胰酶轻度消化后传代3～4次可得到较纯的皮肤成纤维细胞,并经过免疫荧光鉴定;麇鹿染色体数目为2n=68,核型式为2（M）＋64（A）,XY（A,M）;含10％NCS的DMEM培养基最适宜细胞生长;复苏后可获得87．78％的贴壁率。     

兔成纤维细胞的分离与体外培养

用Ⅰ型,Ⅳ型胶原酶消化分离兔皮肤细胞,Ⅰ型胶原酶消化皮肤块获得的细胞数显著高于Ⅳ型胶原酶。用组织块直接培养法,也可以得到皮肤的原代培养细胞,２．５ｇ／Ｌ胰酶消化胎儿组织,可获得足够原代增减２的细胞量。结合使用酶消化法和反复贴壁法,经２－３代后,可获得纯化的成纤维细胞。     

山羊成纤维细胞体外培养研究

分别采用组织块法与消化法对山羊耳成纤维细胞进行原代培养,比较两种方法的培养效果.结果表明,组织块法培养的细胞生长稳定,5～7d有细胞生长,15～18d长满单层;消化法培养的细胞,通过简化酶作用时间及用量的调控,可得到较为单一的成纤维细胞,且经过4～7d生长后能形成单层.同时对细胞培养过程中常遇到的污染问题及解决方法进行了探讨,为动物组织培养研究提供了实验依据.     

欧拉羊胚肾细胞的分离培养和鉴定

[目的]分离培养并鉴定欧拉羊胚肾细胞,为该品种基因组文库构建和遗传多样性研究提供生物学材料。[方法]用胰蛋白酶热消化法分离并培养欧拉羊胚肾原代细胞,通过差速消化和差速贴壁法纯化成纤维细胞,扩大培养至第3代用液氮保存,细胞复苏后进行活力、形态、生长曲线、微生物污染检测和连续传代培养试验。[结果]欧拉羊胚肾细胞呈成纤维型,复苏活力90%以上,生长良好,生长曲线呈"S",最大增殖浓度为4.61×105/ml,倍增时间26 h;细菌、真菌、病毒、支原体检测呈阴性,连续传代培养在10代内生长正常。[结论]欧拉羊胚肾细胞分离培养成功,使这一重要种质资源在细胞水平上得以保存。     

斑马鱼性腺组织的原代细胞培养技术的建立

[目的]建立斑马鱼卵巢和精巢组织的原代细胞培养技术,获得原代和传代培养细胞单层。[方法]采用组织块贴壁法进行斑马鱼卵巢和精巢组织的原代细胞培养,采用0.25%胰蛋白酶消化法进行传代培养。[结果]斑马鱼性腺组织的原代细胞培养条件为:最适培养基为DMEM/F12(p H 7.0~7.2),培养温度为24℃,在添加20 ng/m L表皮生长因子(EGF)、20 ng/m L碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)、0.5 mmol/Lβ-巯基乙醇和15%胎牛血清时更有利于细胞的存活。其中,卵巢的组织块接种3~4 d后,上皮样细胞首先开始迁出,迁出的上皮样细胞生长5 d后,逐渐凋亡;此后,成纤维样细胞和另一种上皮样细胞开始大量迁出,10 d后可生长汇合成80%的原代细胞单层;可成功传代培养1次,但传代后的上皮样细胞不贴壁,很快死亡,而传代后的成纤维样细胞可贴壁生长,但基本不分裂,健康存活7 d后开始逐渐凋亡。精巢组织接种5 d后,上皮样细胞和成纤维样细胞同时开始迁出,培养16 d后逐渐凋亡,仅得到60%原代培养细胞单层。[结论]初步建立了斑马鱼性腺组织的原代细胞培养条件,并将卵巢组织块迁出的成纤维样细胞成功传代1次。     

昆明小鼠ES细胞的分离培养及鉴定

[目的]摸索一种适合昆明小鼠ES细胞分离培养的方法,以提高昆明小鼠ES细胞的建系率。[方法]分别采用5种方法分离ICM和ES细胞集落,摸索了以BMSCs作为饲养层时,丝裂酶素处理的合适时间。[结果]连续消化法要明显好于其他4种方法。MMC处理BMSCs 1、1.5、2 h时效果较好,3个时间点无显著差异(P>0.05)。mMEF作为饲养层与BMSCs作为饲养层时获得5代ES细胞相比差异不显著(P>0.05)。[结论]连续消化法分离ES细胞效率较高,饲养层采用MMC处理1~2 h的BMSCs饲养层或常规mMEF饲养层对昆白小鼠ES细胞无明显影响。     

成年绵羊皮肤成纤维细胞系的建立

本文研究了成年绵羊皮肤成纤维细胞的分离、培养、纯化、冷冻和生长特征。对比了组织块培养和消化培养两种培养方法。根据上皮细胞与成纤维细胞对酶消化敏感性不同及二者贴壁速度的差异,将成纤维细胞分离纯化,建立成年绵羊皮肤成纤维细胞系。     

广西巴马小型猪附睾成纤维细胞的分离培养和鉴定

为了建立广西巴马小型猪附睾成纤维细胞体外培养体系,利用微量液体组织块贴壁法原代培养分离附睾成纤维细胞,进行常规传代培养、冷冻和复苏,并通过接触抑制和解除抑制研究细胞的增殖能力,以及通过免疫荧光对其进行鉴定.结果表明,该法成功分离获得广西巴马小型猪附睾成纤维细胞,并可以大量传代和冷冻,目前已经传至55代以上,生长良好;冷冻复苏和接触抑制解除后仍可以正常培养和传代;细胞免疫荧光检测,波形蛋白表达阳性.可见,通过微量液体组织块贴壁法能成功分离得到广西巴马小型猪附睾成纤维细胞,在体外能稳定培养和传代.     

两种奶牛真皮成纤维细胞分离培养方法的比较

为了比较两种体外分离和培养奶牛真皮成纤维细胞方法，采集奶牛蹄部真皮组织，通过组织块贴壁法和双酶消化法（胰蛋白酶-Ⅰ型胶原酶）分离原代奶牛真皮成纤维细胞，通过传代培养进一步纯化并扩增。利用显微镜观察细胞形态及生长特性，MTT法用于绘制细胞生长曲线，利用细胞免疫荧光技术检测其表面标志物，鉴定细胞纯度。倒置显微镜下观察，贴壁后第6天有细胞爬出，形态多呈长梭形，排列紧密呈漩涡状或束状；双酶消化组第2天有长梭形细胞生长，混杂少量上皮细胞生长。生长曲线图表示，组织块贴壁组细胞生长速度较快。免疫化学荧光检测第四代奶牛真皮成纤维细胞，波形蛋白呈阳性表达，角蛋白-18呈阴性表达，表示细胞纯度较高。两种方法均能分离出奶牛真皮成纤维细胞，与双酶消化法相比，组织块贴壁法分离的细胞纯度更高，活性更佳，增殖周期更短，提示组织块贴壁法是分离培养奶牛真皮成纤维细胞的首选方法。     

寿光黑鸡成纤维细胞的体外培养与冷冻保存(英文)

[Objective] The aim of this study was to establish the in vitro culture system of chicken fibroblasts.[Method] Tissue explant method and enzymatic digestion method were used to separate and culture chicken skin fibroblasts respectively.The rate of cell growth,cryopreservation and recovery were compared.[Result] The primary chicken fibroblasts prepared by enzymatic digestion grew faster and converged together to form monolayer on 5 d post preparation;the passage cells prepared by these 2 methods grew at similar speed and formed monolayer within 2-3 d;homogeneous fibroblasts could be obtained by trypsin digestion and repeated attachment for 3-4 passages;there were 75%-80% of cells survived after cryopreservation and recovery;the growth curves of embryonic fibroblasts and skin fibroblasts were all normal and the two kind of cells still retained the normal number of chromosomes even at the twelfth passage.[Conclusion] The feeder layer cells needed for establishing ES cell lines could be obtained by culturing chicken fibroblasts through both tissue explant method and enzymatic digestion method.This study provided a basis for the successful establishment of ES cell lines.     

牦牛子宫内膜腺上皮细胞分离培养方法比较

[目的]建立牦牛子宫内膜腺上皮细胞体外分离培养方法。[方法]分别采用组织块培养法和消化培养法分离、纯化牦牛子宫内膜腺上皮细胞。[结果]组织块培养约8d细胞可汇合成片,经胰蛋白酶分次消化,可得到纯化的子宫内膜上皮细胞;使用2g／L的胶原酶Ⅱ消化2．5h,更换新鲜消化液继续消化2．5h,消化悬液经74斗“滤网过滤,400r／rain离心5min,收集沉淀,重悬后自然沉降,可得到纯净的腺细胞团。免疫细胞化学显示所得细胞角蛋白染色阳性,阳性率达到95％以上。[结论]2种方法均可得到纯净的牦牛子宫内膜上皮细胞。     

西藏黄牛胎儿成纤维细胞的分离与培养

[目的]以西藏黄牛胎牛为材料,建立西藏黄牛胎儿成纤维细胞系,为在西藏特殊生境条件下高原物种的动物克隆及其他细胞生物学研究提供理想的生物学材料。[方法]对西藏黄牛胎儿成纤维细胞的分离和培养进行了研究。利用组织块法成功分离培养西藏黄牛胎儿成纤维细胞,对细胞的传代培养、形态学和动力学进行观察与分析。[结果]所建立的西藏黄牛胎儿成纤维细胞系具有典型的成纤维细胞形态;西藏黄牛胎儿成纤维细胞要经历滞留期、对数期、平台期,分别为0-2 d、2-7 d、7-8 d,细胞群体倍增时期为60 h。[结论]成功培养了西藏黄牛胎儿成纤维细胞。     

野生渥丹离体培养再生体系的研究

[目的]探索适合的渥丹组织培养方法。[方法]以野生渥丹不同部位的鳞片为外植体,研究不同灭茵时间、不同培养基对外植体组织培养过程的影响。[结果]不同的灭菌时间对鳞片污染率的影响不同,均随着灭菌时间的延长呈显著下降的趋势。不同部位的鳞片污染率差异较大,外部鳞片污染率最高,其次是中部,内部鳞片污染率最低。随着升汞溶液消毒时间的增加,各部位鳞片的增殖系数呈逐渐降低的趋势。以中部鳞片为外植体,灭茵时间为6＋6（min）的效果较好,污染率为59．5％,增殖系数为2．57。诱导不定芽的最适培养基为MS＋NAA0．1mg／L＋6-BA2．0mg／L,增殖系数为4．08。[结论]该研究为保护渥丹种质资源和研发具有自主知识产权的品种奠定了基础。     

鸡精原干细胞分离培养初步研究

[目的]建立禽类精原干细胞(SSCs)体外培养系统。[方法]以25日龄广西土鸡为试材,通过睾丸石蜡切片和HE染色,了解SSCs发育情况,用两步酶消化法分离获得生精上皮细胞,比较不同温度、接种密度对鸡SSCs体外培养的影响,并对SSCs的集落进行染色鉴定。[结果]结果显表明,25日龄时SSCs已经形成,但还未分化。37℃适宜作为鸡SSCs的培养温度,5×105个/ml适宜作为鸡SSCs原代混合培养的接种密度。经碱性磷酸酶和糖原染色鉴定,体外培养的鸡SSCs仍保持未分化的特性。[结论]该研究为禽类SSCs体外培养的基础资料提供参考。     

鸡脯肉和鸡骨架制备鸡精原料的最佳工艺条件研究

[目的]建立一种利用鸡脯肉和鸡骨架制备鸡精原料的工艺简单、成本低、制得产品风味好的方法。[方法]以鸡脯肉和鸡骨架为原料,通过控制合适的原料配比和酶解工艺制备鸡精原料,提高呈现Kokumi风味并减少苦味肽的形成。[结果]分析表明,该试验的处理5的原料配比及酶解工艺制得的鸡精(鸡粉)原料香味及滋味多样,产品品质得到极大提高。[结论]研究解决了目前酶解单一底物存在的弊端,实现了在产品的鸡肉风味得到较大提升的同时,生产成本下降的效果。     

水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的分离·培养和生物学特性研究

[目的]建立一种高效的水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞分离培养方法,为胚胎着床和子宫内膜相关疾病的分子生物学机制研究奠定基础。[方法]采用酶消化、刮取、系列过滤和差速贴壁相结合的方法分离水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞,用免疫细胞化学法和台盼兰染色法检测分离细胞的纯度和活率。[结果]成功分离培养出子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞;免疫荧光染色和细胞计数表明上皮细胞和基质细胞的纯度均达90％以上;台盼兰染色结果显示,上皮细胞的活率为91％,基质细胞的活率为78％。[结论]采用酶消化、刮取、过滤和差速贴壁相结合的方法可分离出高纯度的永牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。     

大叶栎组织培养中外植体褐变的初步研究

[目的]分析大叶栎多酚类物质含量对初代培养外植体褐变的影响情况。[方法]将大叶栎外植体接种在添加不同浓度的活性炭和抗坏血酸的MS培养基上,观察其褐变致死情况。同时对大叶栎不同年龄、不同部位试样的多酚类物质含量进行测定,分析其对初代培养外植体褐变的影响,初步研究降低大叶栎初代培养外植体褐变的措施。[结果]大叶栎不同器官、不同部位的试样多酚类物质含量不同,多酚类物质含量与大叶栎初代培养外植体褐变呈极显著的正相关（r=0.899）,在培养基中添加1.0~3.0 g/L活性炭和0.1~0.3 mg/L抗坏血酸有利于降低大叶栎初代培养外植体的褐变,活性炭的效果略优于抗坏血酸。[结论]大叶栎初代培养外植体的褐变与多酚类物质含量密切相关。     

无花果组织培养中防止外植体褐化的研究

[目的]探讨防止无花果组织培养中外植体褐化的最佳方法。[方法]以无花果幼树顶芽为试材,研究了2种外植体类型、4种消毒方法、同一种消毒剂的不同消毒时间、5种激素组合和3种防褐化剂对无花果组织培养中外植体褐化的影响。[结果]与刚长出幼叶的项芽相比,未发芽的顶芽适宜作防褐化外植体;先将外植体用1000mg／L维生素C溶液浸泡30min,再用浓度0．1％升汞消毒为最佳消毒方法;在一定时间范围内。外植体用浓度10％次氯酸钠消毒时间越长防褐化效果越好;防褐化的最佳激素搭配为6-BA和NAA;3种防褐化荆中以1500mg／L维生素C的抗褐化效果最明显。[结论]选用未分化的顶芽为外植体,浓度0．1％的升汞为消毒剂,MS为基本培养基并附加6-BA1．0mg／L和NAA0．1mg／L进行组织培养。防止外植体褐化的效果最佳。     

不同培养系统和传代方法对昆明白小鼠原始生殖细胞分离培养的影响

[目的]寻求适合昆明白小鼠EG细胞的培养系统和传代方法。[方法]常规方法从昆明白小鼠原始生殖细胞中分离EG细胞,用不同培养系统(EG细胞基础培养液,RH-CM,EG细胞基础培养液+MEF)及不同传代方法(机械法,酶消化法,连同饲养层消化法),研究对昆明白小鼠EG细胞分离克隆的影响。[结果]以RH-CM作为培养基效果最好,RH-CM能够更好地促进EG细胞贴壁增殖和集落的形成,有效地维持EG细胞未分化状态;酶消化法和连同饲养层消化法均能获得较高的克隆形成率。[结论]RH-CM和连同饲养层消化法可分别作为昆明白小鼠EG细胞的培养系统和传代方法。