昆明小鼠ES细胞的分离培养及鉴定

[目的]摸索一种适合昆明小鼠ES细胞分离培养的方法,以提高昆明小鼠ES细胞的建系率。[方法]分别采用5种方法分离ICM和ES细胞集落,摸索了以BMSCs作为饲养层时,丝裂酶素处理的合适时间。[结果]连续消化法要明显好于其他4种方法。MMC处理BMSCs 1、1.5、2 h时效果较好,3个时间点无显著差异(P>0.05)。mMEF作为饲养层与BMSCs作为饲养层时获得5代ES细胞相比差异不显著(P>0.05)。[结论]连续消化法分离ES细胞效率较高,饲养层采用MMC处理1~2 h的BMSCs饲养层或常规mMEF饲养层对昆白小鼠ES细胞无明显影响。     

寿光黑鸡成纤维细胞的体外培养与冷冻保存

[目的]建立鸡成纤维细胞的体外培养体系。[方法]用组织块法和消化法分别分离培养鸡皮肤成纤维细胞;比较细胞生长速率及冻存复苏率。[结果]酶消化培养的成纤维细胞原代生长较快,约5 d便可形成单层;2种方法传代细胞的生长速度相似,仅需2~3 d就可形成单层;使用酶消化法和反复贴壁法,经3~4代后,可获得纯化的成纤维细胞;成纤维细胞经冷冻复苏后有75%~80%存活;分离纯化的胚胎和皮肤成纤维细胞的生长曲线均正常,可传至12代,传代后染色体数目不变。[结论]采用组织块法及酶消化法培养鸡成纤维细胞均可获得ES细胞建系所需的饲养层细胞。该研究为ES细胞系的成功建立奠定了基础。     

大鼠心肌条件培养基在昆明白小鼠胚胎干细胞分离培养中的效果

采用大鼠心肌条件培养基对昆明白小鼠胚胎干细胞进行分离、消化传代、培养鉴定等,研究大鼠心肌条件培养基在昆明白小鼠胚胎干细胞分离培养中的作用效果。结果显示,SD大鼠心肌条件培养基在昆明白小鼠3.5d囊胚胚胎干细胞集落分离中,所分离的昆明白小鼠胚胎干细胞集落具有岛屿状生长,隆起于饲养层上;碱性磷酸酶染色为强阳性;体外分化可形成类胚体状结构,贴壁的类胚体周边会出现许多分化的上皮样细胞或单个散在的细胞;经过常规冻存传代的胚胎干细胞集落具有较为一致的生长形态,并呈现胚胎干细胞集落所特有的岛屿状生长形态;对传至第5代的小鼠胚胎干细胞集落进行核型分析,小鼠胚胎干细胞核型正常率大于75%。试验证实,SD大鼠心肌条件培养基在昆明白小鼠胚胎干细胞分离培养过程中效果较好。     

小鼠睾丸支持细胞的分离培养与生物学研究

[目的]分离得到高纯度的小鼠睾丸支持细胞(Sertoli cell),用以研究它对精原干细胞(SSCs)生长的影响。[方法]取鼠龄3~7 d的雄性ICR小鼠睾丸,采用胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶和DNA酶消化分离Sertoli细胞及SSCs,经多次差异离心贴壁及低渗处理法进行纯化,用Sertoli细胞作饲养层观察SSCs的生长情况。[结果]Sertoli细胞纯度达90%,且以Sertoli细胞作饲养层培养SSCs,与对照相比,能明显促进SSCs的增殖。[结论]四酶消化低渗处理法可获得高纯度的Sertoli细胞,且Sertoli细胞能明显促进SSCs的增殖。     

BRL-CM在昆白小鼠胚胎干细胞分离培养中的应用

目的:探讨Buffalo大鼠肝细胞条件培养基(BRL-CM)在昆白小鼠胚胎干细胞(ES)分离培养中的应用。方法:用BRL-CM培养生长在STO(一种小鼠成纤维细胞)饲养层上的昆白小鼠的桑椹胚和囊胚,然后由囊胚内细胞团(ICM)得到ES细胞集落,在有饲养层和无饲养层时用BRL-CM培养分离得到的ES集落。结果:桑椹胚在上述培养条件下能发育成囊胚,然后囊胚在饲养层上长出ICM;用0.1%Trypsin-0.016%EDTA离散ICM,接种到饲养层上培养得到ES集落,ES集落能维持早期传代。结论:在分离培养昆白小鼠的ES细胞时,BRL-CM结合STO饲养层可以用来培养桑椹胚和囊胚,桑椹胚可以发育为囊胚并孵出内细胞团;同时,这种培养条件也能维持昆白小鼠ES细胞的增殖和早期传代。     

牛原始生殖细胞的分离与培养

从4～15周龄的牛胎儿生殖嵴中分离得到牛原始生殖细胞,以STO(一种建系的小鼠胎儿成纤维细胞)及MEF(小鼠胎儿成纤维细胞)为饲养层抑制分化培养,其中1个细胞系传至4代。研究发现,STO较MEF更有利于牛类EG细胞的分离与培养,体长小于5cm的胎儿适合牛EG细胞分离与克隆。同时观察到这些细胞在体外进行自发性分化,可形成上皮样细胞、神经样细胞和成纤维样细胞。     

小鼠胚胎成纤维细胞分离培养研究

为探索实验室影响小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分离和培养的因素,取昆明白小鼠胚胎分离成纤维细胞,利用体外培养体系,对不同胎龄、不同血清浓度、不同胰蛋白酶浓度和作用时间对MEF分离及培养的影响进行研究,观察MEF的生长形态及其生物学特性.结果表明,在实验室条件下,12.5～14.5 d胎龄的小鼠胎儿MEF分离效果最好;最佳培养基为DMEM添加15;小牛血清;第3代细胞增殖最旺盛;室温条件下,0.125;胰蛋白酶消化MEF时间以8～10 min为宜.在培养ES细胞时,应选择第3～5代的MEF作为饲养层细胞.研究获得了可在实验室分离制备MEF的方法,为实验室进一步分离培养ES细胞奠定基础.     

人类原始生殖细胞的体外培养

为了探讨人原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的体外分离培养条件及相关影响因素,以小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)作为饲养层,室温下用1．25 g／L胰蛋白酶+0．2 g／L EDTA消化人胚胎组织5～9 min,或用1 g／L胶原酶(IV型)消化20～40 min,分离得到PGCs,然后用不同培养液培养,从培养液角度较为系统的研究原代培养人原始生殖细胞的条件。结果表明,在KSR培养液(体积分数15％ Knockout serum replacement+高糖DMEM+10 ng／mL人重组白血病抑制因子(LIF)+4 ng／mL人重组碱性成纤维细胞生长因子+10 ng／mL Forskolin)和STO(建系的小鼠胚胎成纤维细胞)条件培养液中培养的原代人原始生殖细胞,有较高的克隆形成率;培养液中添加不同质量浓度的LIF对克隆形成率影响差异不大。     

小鼠EG细胞体外分化为神经细胞的一种简单有效方法

【目的】探讨一种简单有效的小鼠EG(Embryonic germ cells,EG)细胞体外分化为神经细胞的方法。【方法】将昆明小鼠EG细胞在老化饲养层上培养3~4周,使EG细胞在高密度条件下向神经细胞分化,研究不同浓度维甲酸(Retinoic acid,RA)对EG细胞分化的诱导效果。【结果】小鼠EG细胞在高密度培养条件下向神经细胞分化,可获得较高比例的神经细胞样克隆,nestin染色阳性率达62.9%;经检测EG细胞分化产生的神经细胞样克隆外层细胞,以及从克隆中迁出的细长细胞均表达神经前体细胞标志nestin;在相同RA浓度下,随着EG细胞分化时间的延长,TH+(tyrosine hydroxylase,TH)神经细胞的比例增加;而在不同RA浓度下,随着RA浓度的升高,TH+神经细胞的比例呈增加趋势,经RA诱导14 d,最高可获得(2.3±0.2)%的TH+神经细胞。【结论】昆明小鼠EG细胞在老化饲养层上高密度培养条件下,能自发分化为神经细胞,RA诱导可显著提高分化细胞群体中TH+神经元细胞的比例。试验建立的这种简单有效方法可用于EG细胞体外分化为神经细胞。     

山羊表皮干细胞的分离培养及EGFP基因转染研究

采用组织块法和酶消化法对山羊表皮干细胞进行分离,对分离的表皮干细胞进行了免疫组化染色鉴定,并对其进行了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染研究。结果表明,2种方法均能得到山羊表皮干细胞,其中组织块培养法简单易行,组织块可重复利用,但原代细胞脱出时间较长,平均为8 d,且培养季节对细胞脱出时间、原代传代时间、传代数有显著影响;酶消化法周期短,8 d左右即可传代,不同培养季节对细胞克隆形成时间、细胞传代时间和传代数无显著影响,但处理过程繁琐。EGFP基因在转染表皮干细胞24 h后大量表达,转染率达20%~30%,72 h时转染强度最大,荧光可持续5周;转染使细胞增殖能力明显下降。     

不同饲养层对兔原始生殖细胞传代培养的影响

为了探讨不同饲养层细胞对兔原始生殖细胞体外培养与传代的影响,从14~18 d的兔胎儿生殖嵴中分离得到原始生殖细胞(PGCs),分别培养在小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)、兔胎儿成纤维细胞(REF)饲养层上或与同源兔胎儿生殖脊成纤维细胞(HEFgr)、兔睾丸支持细胞(RSC)共培养。观察兔类EG集落的生长状态,并检测其碱性磷酸酶活性。结果表明:4种方法均能分离克隆出兔类EG集落,碱性磷酸酶染色均呈阳性,但是采用共培养的模式分离得到的集落明显多于传统的饲养层模式。与RSCs共培养得到的EG集落数最多,保持未分化的时间最长,并传了8代,与HEFgr共培养得到的EG集落数与RSCs相比差异不明显,但最高只传了6代。培养在MEF上的兔类EG也能较好的保持未分化状态,传了4代。培养在REF上的兔类EG集落数目较少,出现分化时间较早,只传了3代。因此可以用与RSCs或HEFgr共培养的方法传代培养兔PGCs。     

Improved Isolation and Culture of Embryonic Germ Cells from Guanzhong Dairy Goat

A total of 219 embryonic-germ-cell-like （EG-like） clumps were derived from 15 selected goat fetuses. Isolation of primordial germ cells （PGCs） based on co-culture with primary goat embryonic fibroblast showed no difference from traditional feeder layer-based culture method used in mouse and human. The putative primary EG colonies were multilayer clumps of compact cells with unclear cell-cell boundaries. Three subculture methods of goat EG-like colony, traditional enzymatic digestion, mechanical cutting and combination of the both, were compared in this study. As a result, EG-like colonies traditionally disassociated with collagenase 1V could be subcultured for up to 4 passages. And the mechanically disaggregated EG-like colonies were successfully maintained 9-12 passages with or without enzymatic treatment. The pluripotency of the EG-like colonies was identified by their specific marker staining, spontaneous differentiation and embryoid bodies （EBs） formation in vitro. Most goat EG-like colonies （〉 80%） were AKP positive and immunocytochemically characterized with positive SSEA-1, Oct-4 and c-kit staining but SSEA-4. Under the condition of delaying passage, goat EG-like cells could differentiate into fibroblast-like, epithelium-like, and neuron-like cells. In addition, EBs could be obtained successfully in routine hanging drop culture. The serum free culture system （feeder layer-based） used in this study was suitable for keeping PGCs and EG-like cells in their undifferentiated condition, but failed to converse them to immortal cells. These results indicated that mechanical cutting is an effective method for passaging goat EG cell colonies. However, the microenvironment of conversing EG cells to immortal cells is still unclear.     

大鼠心肌细胞条件培养基对兔胚胎干细胞分离培养效果的影响

采用大鼠心肌细胞条件培养基对兔胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESC)进行分离、传代培养,研究大鼠心肌细胞条件培养基对兔ESC分离培养效果的影响。结果显示,用SD大鼠心肌细胞条件培养基培养的兔ESC集落呈岛屿状生长,碱性磷酸酶染色呈强阳性,体外分化可形成类胚体状结构,贴壁的类胚体周边会出现许多分化的上皮样细胞或单个散在的细胞;常规冻存后再传代的兔ESC集落具有较为一致的生长特征,并呈现胚胎干细胞集落所特有的岛屿状生长形态;传至第5代的兔ESC集落核型正常率>75％。表明SD大鼠心肌细胞条件培养基可用于兔胚胎干细胞分离培养。     

寿光黑鸡成纤维细胞的体外培养与冷冻保存(英文)

[Objective] The aim of this study was to establish the in vitro culture system of chicken fibroblasts.[Method] Tissue explant method and enzymatic digestion method were used to separate and culture chicken skin fibroblasts respectively.The rate of cell growth,cryopreservation and recovery were compared.[Result] The primary chicken fibroblasts prepared by enzymatic digestion grew faster and converged together to form monolayer on 5 d post preparation;the passage cells prepared by these 2 methods grew at similar speed and formed monolayer within 2-3 d;homogeneous fibroblasts could be obtained by trypsin digestion and repeated attachment for 3-4 passages;there were 75%-80% of cells survived after cryopreservation and recovery;the growth curves of embryonic fibroblasts and skin fibroblasts were all normal and the two kind of cells still retained the normal number of chromosomes even at the twelfth passage.[Conclusion] The feeder layer cells needed for establishing ES cell lines could be obtained by culturing chicken fibroblasts through both tissue explant method and enzymatic digestion method.This study provided a basis for the successful establishment of ES cell lines.     

欧拉羊胚肾细胞的分离培养和鉴定

[目的]分离培养并鉴定欧拉羊胚肾细胞,为该品种基因组文库构建和遗传多样性研究提供生物学材料。[方法]用胰蛋白酶热消化法分离并培养欧拉羊胚肾原代细胞,通过差速消化和差速贴壁法纯化成纤维细胞,扩大培养至第3代用液氮保存,细胞复苏后进行活力、形态、生长曲线、微生物污染检测和连续传代培养试验。[结果]欧拉羊胚肾细胞呈成纤维型,复苏活力90%以上,生长良好,生长曲线呈"S",最大增殖浓度为4.61×105/ml,倍增时间26 h;细菌、真菌、病毒、支原体检测呈阴性,连续传代培养在10代内生长正常。[结论]欧拉羊胚肾细胞分离培养成功,使这一重要种质资源在细胞水平上得以保存。     

Hepa1-6细胞的最佳培养条件研究

[目的]探索Hepa1-6细胞的最佳培养条件。[方法]以小鼠Hepa1-6肝癌细胞为材料,采用正交试验设计研究RPMI1640和DMEM2种不同培养基及细胞接种密度、血清浓度、双抗浓度、D-Hanks漂洗次数、胰蛋白酶浓度和消化时间6个不同因素对Hepa1-6传代培养的影响;根据细胞在6个时间点的生长状况评分,筛选出Hepa1-6细胞的最佳培养条件。[结果]Hepa1-6细胞在含有20%血清的RPMI-1640培养基,接种密度为4×104个/cm2,100U/ml的双抗浓度,贴壁率在90%以上时,D-Hanks漂洗1次,0.5%胰蛋白酶消化2min,传代效果最好。[结论]通过正交设计筛选,为Hepa1-6细胞体外培养探索出最佳培养条件。     

Hepa1-6细胞的最佳培养条件研究

[目的]探索Hepa1-6细胞的最佳培养条件。[方法]以小鼠Hepa1-6肝癌细胞为材料,采用正交试验设计研究RPMI1640和DMEM2种不同培养基及细胞接种密度、血清浓度、双抗浓度、D-Hanks漂洗次数、胰蛋白酶浓度和消化时间6个不同因素对Hepa1-6传代培养的影响;根据细胞在6个时间点的生长状况评分,筛选出Hepa1-6细胞的最佳培养条件。[结果]Hepa1-6细胞在含有20%血清的RPMI-1640培养基,接种密度为4×104个/cm2,100U/ml的双抗浓度,贴壁率在90%以上时,D-Hanks漂洗1次,0.5%胰蛋白酶消化2min,传代效果最好。[结论]通过正交设计筛选,为Hepa1-6细胞体外培养探索出最佳培养条件。