山羊转t-PA突变体基因的体细胞核移植研究

比较了用转t-PA突变体基因的胎儿成纤维细胞和卵丘细胞作供体时核移胚的发育情况。结果表明：卵丘细胞作供体时,核移胚的卵裂率（82.9%）和桑葚胚率（55.9%）均高于胎儿成纤维细胞卵裂率（75.7%）和桑葚胚率（48.7%）,但差异不显著（P＞0.05）;卵丘细胞作供体时的囊胚率（19.7%）则高于胎儿成纤维细胞（11.0%）,差异显著。(P<0.05)。比较了饥饿处理与否对胎儿成纤维细胞作供体时转基因核移胚的发育情况。结果表明：供体细胞饥饿后,其核移胚的卵裂率（75.6%）与供体不饥饿的卵裂率（75.8%）差异不显著;供体细胞饥饿后,其核移胚的桑葚胚率（46.5%）和囊胚率（11.0%）高于供体不饥饿的桑葚胚率（39.3%）和囊胚率（9.0%）,但差异不显著。比较了SOFaa和CR1aa分别添加10%FBS和bFF后,转基因核移胚的发育情况。结果表明：用CR1aa液培养时,添加10%bFF,其囊胚率（9.1%）高于添加10%FBS（4.2%）（P＞0.05）;用SOF液培养时,添加10%bFF,其囊胚率（11.2%）高于添加10%FBS（5.5%）（P＞0.05）。说明用SOF液优于CR1aa液。     

山羊卵母细胞的体外成熟研究

1.比较了在卵母细胞成熟液中添加相同浓度(10ng/ml)的表皮生长因子(EGF),胰岛素样生长因子(IGF),EGF IGF后,不同生长因子对卵母细胞体外发育率的影响。结果表明,在成熟培养液中添加EGF后,其卵母细胞的成熟率(70.9%)与对照组(67.3%)相比有所提高,但差异不显著;在成熟培养液中分别添加IGF、EGF IGF,其卵母细胞的成熟率分别为80.0%,82.4%,显著高于对照组卵母细胞的成熟率(67.3%)。2.比较了不同季节采集的卵母细胞在体外成熟的情况。结果发现,12月份到来年的1月份,采集的卵母细胞,其体外成熟率最高,为81.0%;11月份采集的卵母细胞,其体外成熟率次之,为74.1%;3—5月份和9—10月份采集的卵母细胞,其体外成熟率为66.0%、69.6%;6—7月初采集的卵母细胞,其体外成熟率最差,为54.7%。3.比较了OM液pH值对卵母细胞体外成熟的影响。当OM培养液的pH值为7.2和6.8￣7.0时,卵母细胞成熟率的为66.2%和61.0%,显著高于pH≥7.5时的成熟率(50.9%,P<0.05)。     

山羊转t-PA突变体基因的体细胞核移植研究

比较了用转t-PA突变体基因的胎儿成纤维细胞和卵丘细胞作供体时核移胚的发育情况。结果表明:卵丘细胞作供体时,核移胚的卵裂率(82.9%)和桑葚胚率(55.9%)均高于胎儿成纤维细胞卵裂率(75.7%)和桑葚胚率(48.7%),但差异不显著(P>0.05);卵丘细胞作供体时的囊胚率(19.7%)则高于胎儿成纤维细胞(11.0%),差异显著。(P<0.05)。比较了饥饿处理与否对胎儿成纤维细胞作供体时转基因核移胚的发育情况。结果表明:供体细胞饥饿后,其核移胚的卵裂率(75.6%)与供体不饥饿的卵裂率(75.8%)差异不显著;供体细胞饥饿后,其核移胚的桑葚胚率(46.5%)和囊胚率(11.0%)高于供体不饥饿的桑葚胚率(39.3%)和囊胚率(9.0%),但差异不显著。比较了SOFaa和CR1aa分别添加10?S和bFF后,转基因核移胚的发育情况。结果表明:用CR1aa液培养时,添加10?F,其囊胚率(9.1%)高于添加10?S(4.2%)(P>0.05);用SOF液培养时,添加10?F,其囊胚率(11.2%)高于添加10?S(5.5%)(P>0.05)。说明用SOF液优于CR1aa液。     

CCB、蔗糖及成熟时间对山羊卵母细胞去核效果的影响

分离培养山羊卵母细胞,采用盲吸法去核,研究不同成熟培养时间(18,22和26 h)不同细胞松弛素B(CCB)浓度(5,7.5,10,15 mg/L)和不同蔗糖浓度(20,25,30 g/L)对卵母细胞去核效果的影响。结果表明,山羊卵母细胞最佳去核条件为:卵母细胞体外成熟时间为22 h,去核时操作液中CCB质量浓度为7.5 mg/L,蔗糖质量浓度为20 g/L。     

山羊卵母细胞的体外成熟研究

1.比较了在卵母细胞成熟液中添加相同浓度(10ng/ml)的表皮生长因子(EGF),胰岛素样生长因子(IGF),EGF IGF后,不同生长因子对卵母细胞体外发育率的影响。结果表明,在成熟培养液中添加EGF后,其卵母细胞的成熟率(70.9%)与对照组(67.3%)相比有所提高,但差异不显著;在成熟培养液中分别添加IGF、EGF IGF,其卵母细胞的成熟率分别为80.0%,82.4%,显著高于对照组卵母细胞的成熟率(67.3%)。2.比较了不同季节采集的卵母细胞在体外成熟的情况。结果发现,12月份到来年的1月份,采集的卵母细胞,其体外成熟率最高,为81.0%;11月份采集的卵母细胞,其体外成熟率次之,为74.1%;3—5月份和9—10月份采集的卵母细胞,其体外成熟率为66.0%、69.6%;6—7月初采集的卵母细胞,其体外成熟率最差,为54.7%。3.比较了OM液pH值对卵母细胞体外成熟的影响。当OM培养液的pH值为7.2和6.8￣7.0时,卵母细胞成熟率的为66.2%和61.0%,显著高于pH≥7.5时的成熟率(50.9%,P<0.05)。     

克服小鼠早期胚胎体外培养发育阻滞的研究

为探讨不同培养基及共培养对克服小鼠早期胚胎体外发育阻滞的影响,用不同成分组成的5种常用培养液对小鼠早期胚胎进行体外培养,后以KSOM作为基础培养基,KSOMFBS为对照,分别与小鼠输卵管上皮细胞(MOEC)和卵丘细胞(CC)进行共培养,观察从2细胞发育到4细胞的胚胎数和囊胚数的变化。结果发现5种培养液中从2-细胞发育到4-细胞的胚胎率为30.5%~43.5%,差异不显著。KSOM组囊胚率为40.9%,显著高于其他各组(27.9%~30.0%)。共培养后,各组中克服发育阻滞的胚胎数和囊胚数均有显著提高,其中添加胎牛血清组4细胞胚胎数和囊胚数显著高于不添加组,输卵管上皮细胞组显著高于卵丘细胞组。结果显示共培养对克服小鼠2-细胞发育阻滞作用明显,添加胎牛血清效果明显好于不添加,输卵管上皮细胞共培养效果好于卵丘细胞。     

优化山羊体细胞核移植方案的研究

以乳腺细胞、胎儿成纤维细胞和颗粒细胞为供体细胞进行核移植，比较了供体细胞类型、细胞冷冻及核移植的重建方法（胞质内注射、电融合）对重构胚早期发育的影响。结果：（1）乳腺细胞支持重组胚的发育能力（囊胚率7．14％）显著低于成纤维细胞（16．19％）和颗粒细胞（19．01％）（P〈0．05），卵裂率无显著差异（P〉0．05）；（2）乳腺上皮细胞构建重组胚时电融合法的效率（69．52％）极显著高于胞质注射法（59．20％）（P〈0．01）；成纤维细胞的重组成功率、卵裂率和囊胚率在两种方法间均无显著差异（P〉0．05）；在颗粒细胞，胞质注射法重组成功率（82．17％）显著高于电融合法（50．99％）（P〈0.05），其囊胚率也稍高于电融合法，但无显著差异（P〉0.05）；（3）上述3种供体细胞在冻融后支持重组胚发育力方面无显著差异（P〉0.05）。结论：在山羊体细胞核移植中，上述3种细胞支持重组胚的发育力以成纤维细胞和颗粒细胞较好；细胞冷冻对其无显著影响；在构建重组胚方法上，乳腺细胞以电融合法为宜，颗粒细胞是胞质注射法优于电融合法，而成纤维细胞两种方法均可。