泥鳅鳍细胞系的构建及特性分析

采用组织块培养法对泥鳅Misgurnus anguillicaudatus鳍组织细胞进行原代培养,并采用胰蛋白酶消化法传代,目前已传63代。原代培养和早期传代培养所用培养基为DMEM/F12,并添加体积分数为20%的胎牛血清(FBS)、10 ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20 ng/mLⅠ型胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)和10μg/mL硫酸软骨素。30代以后所用培养基为20%FBS-DMEM/F12,在CO2培养箱(5%,25℃)中培养,培养的鳍细胞形态为成纤维细胞样,群体倍增时间为56.85 h,特征染色体数目为50条;细胞经液氮冷冻保存30 d,解冻复苏后,存活率为81.31%±1.46%。病毒敏感性试验结果表明,泥鳅鳍细胞系对鲤春病毒血症病毒(SVCV)敏感,病毒滴度为105.62TCID50/mL,而对鱼类诺达病毒(YGNNV)不敏感。泥鳅鳍细胞系的建立丰富了鱼类细胞系的种类,并为泥鳅毒理学、病毒学的研究提供了科学依据。     

大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏组织原代培养的研究

应用组织块培养法,研究了大泷六线鱼Hexagrammos otakii鳍、吻端和肾脏细胞在含有体积分数为20％胎牛血清(FBS)的L-15、DMEM和DMEM/F12 3种培养基中的生长情况,以及人碱性成纤维细胞(bFGF)、硫酸软骨素、Ⅰ型胰岛素样(IGF-Ⅰ)3种生长因子对细胞贴壁率和迁出率的影响.结果表明:大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏细胞适宜的体外培养体系为DMEM/F12培养基+20％ FBS,pH为7.2,温度为25℃;在最适培养基中分别添加5.0 ng/mL bFGF、20 μg/mL硫酸软骨素、40 ng/mL IGF-Ⅰ时,3种组织的贴壁率和细胞迁出率均最高;鳍、吻端和肾脏组织分别经培养21、15、18 d后长满单层,主要为成纤维样细胞;采用低渗滴片法制备染色体,3种组织原代细胞的染色体数目为48条.本研究为大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏组织细胞系的构建和生物学特性的研究奠定了基础.     

斑马鱼性腺组织的原代细胞培养技术的建立

[目的]建立斑马鱼卵巢和精巢组织的原代细胞培养技术,获得原代和传代培养细胞单层。[方法]采用组织块贴壁法进行斑马鱼卵巢和精巢组织的原代细胞培养,采用0.25%胰蛋白酶消化法进行传代培养。[结果]斑马鱼性腺组织的原代细胞培养条件为:最适培养基为DMEM/F12(p H 7.0~7.2),培养温度为24℃,在添加20 ng/m L表皮生长因子(EGF)、20 ng/m L碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)、0.5 mmol/Lβ-巯基乙醇和15%胎牛血清时更有利于细胞的存活。其中,卵巢的组织块接种3~4 d后,上皮样细胞首先开始迁出,迁出的上皮样细胞生长5 d后,逐渐凋亡;此后,成纤维样细胞和另一种上皮样细胞开始大量迁出,10 d后可生长汇合成80%的原代细胞单层;可成功传代培养1次,但传代后的上皮样细胞不贴壁,很快死亡,而传代后的成纤维样细胞可贴壁生长,但基本不分裂,健康存活7 d后开始逐渐凋亡。精巢组织接种5 d后,上皮样细胞和成纤维样细胞同时开始迁出,培养16 d后逐渐凋亡,仅得到60%原代培养细胞单层。[结论]初步建立了斑马鱼性腺组织的原代细胞培养条件,并将卵巢组织块迁出的成纤维样细胞成功传代1次。     

南方鲇肾细胞系(SMK-Ⅰ)的建立及其细胞骨架的研究

南方鲇肾细胞系(SMK-Ⅰ)在培养初期为成纤维样和上皮样细胞的混合细胞系, 随着传代次数的增加, 形成了稳定的成纤维型细胞系; SMK-Ⅰ细胞的生长周期为7～8天; 大多数细胞的染色体为二倍性, 也观察到染色体多倍化和异倍化的细胞群体; 流式细胞仪分析不同代龄的细胞周期, 发现该细胞系G2-M期细胞的数量, 随着代龄的增加, 逐渐增多, 说明该细胞系已经成功转化; Pena法显示其细胞骨架网络比较分散, 且随细胞贴壁的情况和本身的形态而异.     

南方鲇肾细胞系(SMK-Ⅰ)的建立及其细胞骨架的研究

南方鲇肾细胞系（SMK-Ⅰ）在培养初期为成纤维样和上皮样细胞的混合细胞系,随着传代次数的增加,形成了稳定的成纤维型细胞系;SMK-Ⅰ细胞的生长周期为7～8天;大多数细胞的染色体为二倍性,也观察到染色体多倍化和异倍化的细胞群体;流式细胞仪分析不同代龄的细胞周期,发现该细胞系G2-M期细胞的数量,随着代龄的增加,逐渐增多,说明该细胞系已经成功转化;Pena法显示其细胞骨架网络比较分散,且随细胞贴壁的情况和本身的形态而异.     

天然二倍体和四倍体泥鳅鳍细胞系染色体组构成研究

对传代20次的天然二倍体和天然四倍体泥鳅鳍细胞系进行染色体标本制备,并对其染色体核型、Ag-NORs及CMA3/DA/DAPI三重荧光染色等进行研究。结果显示,1二倍体泥鳅鳍组织培养细胞的染色体数目为2n=50,核型公式为:2n=10m+4sm+36t,NF=64;四倍体泥鳅鳍组织培养细胞的染色体数目为4n=100,核型公式为:4n=20m+8sm+72t,NF=128。2天然二倍体泥鳅鳍培养的细胞中期染色体分裂相有2个Ag-NORs,天然四倍体泥鳅鳍培养的细胞中期染色体分裂相有4个Ag-NORs,均位于第1对中部着丝粒染色体(M1)的末端。3天然二倍体泥鳅鳍培养的细胞染色体中期分裂相中CMA3阳性位点为2个,天然四倍体泥鳅鳍培养的细胞染色体中期分裂相中CMA3阳性位点为4个;均位于核仁组织区,即第1对中部着丝粒染色体(M1)的末端。结果表明,天然二倍体和四倍体泥鳅鳍培养细胞制备的染色体数目、核型和带型与体细胞一致。     

粘虫细胞培养及苦皮藤素Ⅳ,Ⅴ对其毒力的研究

以东方粘虫(MythimnaseparateWalker)为材料建立了新的昆虫细胞系,原代培养6个月后,胚胎细胞开始传代;用苦皮藤素和处理第3代传代细胞,24h后细胞裂解,出现大量细胞碎片,培养液变浑浊,其致死中质量浓度分别为76.42和129.34μg/mL。粘虫背纵肌经胰蛋白酶部分消化后在Grace培养液中生长良好,培养2个月后有大量肌卫星细胞出现。     

奶山羊胎儿成纤维细胞系的建立及其生物学特性分析

试验分别采用组织块贴壁法和消化分离法对奶山羊胎儿成纤维细胞进行体外培养,通过原代培养、细胞传代、冷冻保存等成功建立了奶山羊胎儿成纤维细胞系,并对该细胞系进行了形态学观察、生长动力学分析、细胞活力测定、核型分析和微生物检测等多种生物学特性分析.结果表明:成纤维细胞原代培养采用贴块培养时所需时间较长,消化培养有较多死细胞;传代细胞生长情况良好,群体倍增时间(PDT)约为40.4h;生长总体趋势呈"S"型;冻存后活力为92.3%,生长状况与冻存前一致;细胞染色体中二倍体(2 n=60)占主体;细菌、真菌和支原体检测结果均为阴性,细胞系的各项指标均达到ATCC细胞系鉴定标准.     

Marc-145细胞低血清适应培养传代稳定性和无血清驯化研究

通过驯化建立无血清悬浮培养型Marc-145细胞系,分析驯化传代对细胞特性的影响,为大规模生产疫苗用的宿主细胞提供基础。采用缓降培养液中血清浓度的方法,连续传代培养50代,并用无血清培养基进行悬浮培养驯化,对传代和驯化过程中的P10、P20、P30、P40和P50代细胞的形态、倍增时间、生长曲线、染色体和对蓝耳病病毒敏感性等特性进行对比分析。研究发现,传代过程中Marc-145细胞均呈扁平多边形上皮样生长,P10代细胞倍增时间为34.15 h,P50代细胞倍增时间为36.16 h,P50代细胞倍增时间稍有延长但差异不显著。P10、P20、P30、P40和P50代的Marc-145细胞生长曲线均呈“S”形;P10代和P50代细胞染色体众数都集中在88~90条。接种病毒后,P10、P20、P30、P40和P50细胞TCID₅₀间无显著差异,表明细胞传50代后,细胞特性没有发生明显变化。P50细胞进行无血清悬浮培养48 h后,细胞密度可达到4.14×10⁶ mL^-1。     

镉对体外培养小鼠皮肤细胞存活的影响

研究不同浓度的氯化镉对体外培养的小鼠皮肤细胞存活影响。采用组织块法启动小鼠皮肤细胞的原代培养,胰酶消化法传代培养,利用光镜观察、MTT细胞毒性分析、荧光染色和DNA琼脂糖凝胶电泳等方法研究镉对小鼠皮肤细胞的毒性作用。结果显示,在37℃,含20%胎牛血清的DMEM/F12培养条件下,小鼠皮肤组织原代启动第2天即有细胞迁出,为成纤维样细胞形态,生长分裂旺盛,第6天即可长成汇合的细胞单层,并能稳定连续传代。20~160μmol/L氯化镉可显著降低体外培养的小鼠皮肤细胞的存活率,具有浓度和时间的依赖性。处理24和48 h对肝细胞的半致死率浓度分别为39.81和22.39μmol/L。Cd Cl2处理导致皮肤细胞染色质的凝缩和片段化,诱导细胞凋亡。     

三丁基氯化锡对僧帽牡蛎抗氧化酶活性的影响

[目的]探讨三丁基氯化锡（TBTCl）对僧帽牡蛎抗氧化酶系统毒性的影响程度及致毒机制。[方法]在实验室条件下,研究不同浓度（1、2、5、10和100rig／L）的三丁基氯化锡（TBTC1）在不同暴露时间（24、72、96h）对僧帽牡蛎消化腺和鳃的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和硒依赖谷胱甘肽过氧化酶（Se—GPx）活性的影响。J结果]当佃TCl浓度为1和2ng／L时,在整个实验期间TBTCl对消化腺和鳃内SOD和Se—GPx活性无显著影响（P〉0．05）,而对消化腺CAT活性有显著诱导作用（P〈0．05）。当TBTcl浓度为5～100ng／L时,SOD、CAT和Se—GPx的活性都呈现不同程度的时间剂量依赖关系。[结论]该研究可为餐桌食品污染的防患、无公害水产品的生产和环境检测提供科学依据。     

FSH对体外培养猪卵巢颗粒细胞生长及增殖的影响

采集成年健康母猪的卵巢,收集卵泡颗粒细胞,在配制好的培养液中培养。颗粒细胞原代培养体系建立成功后,分别将不同质量浓度的FSH(0.1,0.5,1,5,25 ng/mL)作用于细胞,每隔48 h换1次培养液,加入新的FSH,倒置显微镜下检测细胞的生长及增殖状况。结果表明,FSH质量浓度越大,细胞生长状况越好,差异有统计学意义(P<0.05);在固定质量浓度的FSH作用下,细胞每次换液后生长状况都会变好。FSH能促进猪卵泡颗粒细胞增殖,并与作用时间长短有关。     

牙鲆孵化腺的细胞化学研究

[目的]研究牙鲆胚胎发育过程中孵化腺细胞的分化规律。[方法]采用常规固定、切片方法,利用高碘酸-雪夫染色反应（PAS）对各个发育时期的牙鲆胚胎和孵化后的仔鱼切片进行染色。[结果]典型的孵化腺细胞（阳性细胞）出现于孵化前15h,位于胚胎的前中部,孵化腺细胞的数量和体积均在孵化前达到最大值,且均位于胚胎头部和背部表面。一旦孵化结束,孵化腺细胞的数量和体积均急剧下降,并于孵化后13h消化。[结论]牙鲆胚胎中孵化腺细胞的变化规律与其发育进程密切相关。     

红笛鲷血清性类固醇激素周年变化的初步研究

应用放射免疫分析法测定红笛鲷雌、雄鱼血清性类固醇激素雌二醇、睾酮和孕酮的周年变化水平。结果表明,雌、雄鱼血清雌二醇、孕酮的变化趋势相似,3～10月雌二醇水平较低,11月以后不断升高,至次年2月雌鱼达到1257．46±447．20pg／mL,雄鱼达到1179．14±322．50pg／mL;4、5月孕酮水平较高,雌鱼在5月达到高峰118．49＋18．45ng／mL,雄鱼4月达到高峰109．98±60．97ng／mL,之后一直在比较低水平波动;雄鱼睾酮水平有一定规律性,3～9月一直处于比较高水平,8月达到高峰0．27±0．24ng／mL,而雌鱼睾酮水平周年变化没有规律性,最高水平在6月,达到0．28±0．13ng／mL。     

成年雌性比格犬发情期中生殖激素变化规律

研究成年雌性比格犬体内促黄体生成激素（LH）、雌二醇（E2）及孕酮（P）的分泌规律。采用放射免疫法测定母犬发情期内血清中LH、E2及P的含量。所有10只成年雌性比格犬LH浓度在发情前期开始后8～11d达到最高浓度7.41±0.48mU/mL。E2浓度在发情前期开始后的7～11d达到最高值80.64±5.73pg/mL,有8只成年雌性比格犬E2的峰值出现在LH峰值前24h,之后迅速下降,同时P浓度开始初次升高,并维持在这一浓度（14.16±2.52ng/mL）3～5d之后继续升高,P在LH峰值后的10～14d达到最高值36.19±2.04ng/mL。实验表明E2对LH峰值的出现具有负反馈调节作用,E2∶P浓度比的下降促使LH峰值出现。     

氯化镉对不同倍性泥鳅鳍细胞系的毒性效应

旨在研究不同浓度氯化镉对60~80 代二倍体和三倍体泥鳅鳍细胞系（DIMF和TRMF）的毒性效应,比较不同倍性细胞系间的敏感性差异。采用MTT比色法测定半致死浓度,采用酶活力测定法、微核试验和实时定量PCR法测定了氯化镉对2 种细胞系的细胞毒性和遗传毒性。结果表明：氯化镉处理下DIMF、TRMF细胞系半致死浓度分别为(24.0±0.7)、(27.3±1.3) μmol/L。2 种细胞系的SOD、GSH-Px活性随着氯化镉浓度的增加,呈现先升高后降低的趋势,而GST活性则表现为逐渐降低。随着氯化镉浓度的增加微核率先升高后降低,DIMF、TRMF最大微核率分别为(7.33±0.33)‰、(8.33±0.67)‰。经氯化镉处理的细胞金属硫蛋白(MT)表达量显著增加,30 μmol/L 浓度组表达量最大,分别为对照组的55.6 和57.6 倍。研究表明,氯化镉对泥鳅二倍体和三倍体细胞系具有细胞毒性和遗传毒性,且二倍体细胞系较三倍体细胞系对氯化镉更为敏感。     

农杆菌介导的曼地亚红豆杉细胞遗传转化体系的建立

建立了根癌农杆菌介导的红豆杉细胞遗传转化体系,为红豆杉细胞的遗传改良打下基础。最优转化条件是:菌液光密度A600=0.6,侵染时间25 min,共培养最适温度21℃,共培养时间48 h;最适头孢霉素(Cephamycin,Cef)抑菌浓度为300 mg/L;最优的除菌及筛选方式为:用含100 mg/L头孢霉素的无菌水冲洗共培养后的细胞10 s,然后将细胞转至含300 mg/L头孢霉素的抑菌培养基上,两周后转至含150 mg/L卡那霉素(Kanamycin,Kan)或8 mg/L潮霉素(Hygromycin,Hyg)的筛选培养基上筛选。采用小愈伤团法筛选转基因纯系,GUS染色显示,筛选后转化细胞株的阳性细胞占80%以上。     

山羊原始生殖细胞的分离与培养

从46例山羊胎儿中分离培养原始生殖细胞,发现胎龄在25～38d的胎儿原代培养时都可获得大量的细胞集落,适合做胚胎生殖细胞的分离培养,最高传至6代。以小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)、山羊胎儿成纤维细胞(GEF)、牛胎儿成纤维细胞(BEF)为饲养层,在不添加细胞因子情况下,都可以培养出原代山羊的胚胎生殖细胞。传代结果表明,MEF的培养效果较好,但与GEF组差异不显著(P>0.05),BEF组培养效果较差(P<0.05)。以3个不同质量浓度LIF的培养液培养山羊原始生殖细胞(PGC)结果表明,在原代培养时,效果差异不显著(P>0.05);而在传代过程中,以含LIF10ng/mL组培养效果最好,但与含LIF5ng/mL组差异不显著(P>0.05),LIF1ng/mL组培养效果较差(P<0.05)。     

多拉菌素在犬体内药代动力学研究

 采用RP-HPLC法荧光监测器测定单剂量皮下注射多拉菌素［300μg/（kg BW）］）后，犬体内不同时间点的血浆药物浓度。血浆药物浓度-时间数据采用3P97药动软件分析。结果表明，本试验条件下血浆中药物添加浓度在0.1～100 ng/mL范围内与峰面积呈良好线性关系，检测限为0.5 ng/mL。不同浓度水平的日内日间变异系数分别小于3%和4%，各浓度的平均回收率均大于90%。给药后血药浓度－时间数据符合一级吸收一室开放模型，主要药物动力学参数为：t_1/2ka为（0.58±0.13）d，t_1/2β为（4.78±0.31）d，T_max为（2.00±0.29）d，C_max为（20.29±2.04）ng/mL，AUC为（187.43±24.99）（ng·d）/mL。提示多拉菌素在犬体内血药浓度维持的时间长，消除缓慢，且根据其半衰期判断，多拉菌素属于慢性消除药物。