不同浓度胰岛素对鸡胚盲肠上皮细胞生长的影响

为了探讨不同浓度的胰岛素对体外培养的鸡胚盲肠上皮细胞生长和增殖的影响,试验选用16日龄SPF鸡胚,采用嗜热菌蛋白酶消化法无菌分离鸡胚盲肠组织,以含不同质量浓度胰岛素(0、5、10、15、20μg/m L)的培养基对盲肠上皮进行体外培养,对细胞克隆形成率、生长曲线和上皮细胞角蛋白18进行测定。结果表明,培养基中添加10μg/m L胰岛素时,鸡胚盲肠上皮细胞的增殖差异极显著,胰岛素质量浓度为15、20μg/m L时,鸡胚盲肠上皮细胞增殖略有升高,但与胰岛素10μg/m L组相比,细胞增殖差异不显著;角蛋白18鉴定结果为阳性。表明在体外鸡胚盲肠上皮细胞培养中,10μg/m L胰岛素能促进鸡胚盲肠上皮细胞分裂、生长和增殖。胰岛素作为一个体外细胞生长的关键因子,可促进鸡胚盲肠上皮细胞的生长和增殖。     

鸡胚盲肠上皮细胞体外培养纯化方法的研究

为探讨鸡胚盲肠上皮细胞体外培养的纯化方法,采用低速离心去除单细胞、差速贴壁去除成纤维细胞纯化上皮细胞,并对培养细胞的纯度进行了测定。结果表明:采用1200r.min-1 5min的离心条件,利用贴壁差细胞种植1.5h后倒瓶的方法可去除部分单细胞和大部分纤维细胞,细胞种植第3天～第11天纯度可达72.00%以上。提示低速离心结合差速贴壁法可达到纯化盲肠上皮细胞的目的,可为试验研究提供较为理想的细胞模型。     

不同培养条件下欧洲鳗鲡胸鳍传代细胞的生长优势

为建立欧洲鳗鲡病毒性疾病分离、鉴定的细胞模型,以欧洲鳗鲡胸鳍细胞人工培养适应株(第21代)为试验材料,采用人工培养基体外传代培养的方法,探讨欧洲鳗鲡胸鳍传代细胞体外培养的最适条件。观察比较不同培养基(L-15、RPMI-1640、高糖型DMEM)、血清成分(BS和FBS)及其浓度(5%、10%、15%、20%)对欧洲鳗鲡胸鳍细胞生长状态的影响。结果表明:含有10%胎牛血清(FBS)的L-15培养基最适合欧洲鳗鲡胸鳍细胞的生长。     

消化酶及胎牛血清对奶牛乳腺上皮细胞培养的影响

本试验研究了不同浓度及组合消化酶对奶牛乳腺组织分离的影响以及不同FBS浓度培养基对奶牛乳腺上皮细胞纯化和生长的影响。试验结果表明0.25%胰酶＋0.2%Ⅱ胶原酶对组织块分离效果最好,乳腺上皮细胞生长最多,5%与10%浓度FBS对奶牛乳腺上皮细胞纯化效果最好,5%与10%浓度FBS对细胞生长没有明显的差异（p〉0.05）,但明显高于其他处理组（p〈0.01）。     

EGF·Insulin和IGF-I对食蟹猴耳部成纤维细胞体外增殖的影响

探讨了培养基中不同浓度血清情况下,分别添加不同浓度的表皮生长因子（EGF）、胰岛素（Insulin）和胰岛素样生长因子-I（IGF-I）对食蟹猴耳部成纤维细胞体外增殖的影响,目的是寻找这3种物质促进体外培养成纤维细胞的最佳浓度,改善细胞体外培养系统,为以后体细胞及干细胞培养提供参考。将处于对数生长期的10～15代细胞进行常规消化混匀,计数,接种,培养24h后分别向孔中加入含5％和10％的两种血清浓度、添加不同浓度的EGF、Insulin和IGF-I的培养基,6d后分别向孔中加入MTT,然后用酶联免疫检测仪测定各孔在492nnl处的吸光度值（0D）。血清浓度为10％情况下,培养基中添加10ng／ml EGF、10μg／ml Isulin、100ng／ml IGF-I时,食蟹猴耳部成纤维细胞增殖能力最好。     

EGF·Insulin和IGF-I对食蟹猴耳部成纤维细胞体外增殖的影响

探讨了培养基中不同浓度血清情况下,分别添加不同浓度的表皮生长因子（EGF）、胰岛素（Insulin）和胰岛素样生长因子-I（IGF-I）对食蟹猴耳部成纤维细胞体外增殖的影响,目的是寻找这3种物质促进体外培养成纤维细胞的最佳浓度,改善细胞体外培养系统,为以后体细胞及干细胞培养提供参考。将处于对数生长期的10～15代细胞进行常规消化混匀,计数,接种,培养24h后分别向孔中加入含5％和10％的两种血清浓度、添加不同浓度的EGF、Insulin和IGF-I的培养基,6d后分别向孔中加入MTT,然后用酶联免疫检测仪测定各孔在492nnl处的吸光度值（0D）。血清浓度为10％情况下,培养基中添加10ng／ml EGF、10μg／ml Isulin、100ng／ml IGF-I时,食蟹猴耳部成纤维细胞增殖能力最好。     

稀土元素对仓鼠细胞和鸡胚细胞生长的影响

为从细胞学水平揭示稀土元素对动物的促生长机理,本文选择中国仓鼠肺成纤维细胞(Wg_3 1)和卵巢细胞(CHO),在含有不同浓度 STN 的1640完全培养液中培养;以及来自非免疫健康鸡群11日龄鸡胚所制成的鸡胚细胞,使之在0ppm、1.25ppm、2.5ppm、5ppm,10ppm、20ppm 和40ppm 稀土浓度的199培养液中培养.CHO 细胞的生长速率表现在10ppm浓度时细胞数最多,Wg_3 1 和 CHO 的细胞分裂指数也以10ppm 时显著高于对照组(P<0.05).96小时鸡胚细胞单层面形成状况表明:三种类型的稀土化合物均以5ppm 浓度时对鸡胚细胞的促生长作用最明显,STV-2优于 CL-1,CL-1优于 CL-3.20ppm 和40ppm 浓度使 CHO、Wg_3 1和鸡胚细胞生长受到抑制.结论认为,适量浓度的稀土可促进动物细胞生长,高浓度稀土抑制动物细胞生长.     

王浆主蛋白(MRJPs)对张氏肝细胞的促增殖作用及其机制

将王浆主蛋白(major royal jelly proteins,MRJPs)添加到细胞培养基中,用MTT法比较纯MRJPs与胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、不同MRJPs/FBS比例对张氏肝细胞增殖的影响,用流式细胞仪检测MRJPs各处理对细胞周期的影响。结果表明:仅添加MRJPs不能促进细胞增殖;完全培养基(10%FBS)中MRJPs的最佳添加量为0.5mg/mL;MRJPs(5mg/mL)/FBS的添加比例为60/40时混合培养基对细胞的促增殖效果与完全培养基相比差异无统计学意义(P0.05)。流式细胞仪检测结果显示,MRJPs与FBS配合使用可促使细胞S期及G0/G1期比例增大;推测MRJPs的作用可能与促进DNA合成、前期RNA和核糖体合成有关。     

食蟹猴支持细胞的分离、纯化以及不同血清浓度对其增殖的影响研究

[目的]纯化培养食蟹猴支持细胞,并测定不同血清浓度对细胞增殖的影响。[方法]分离并纯化食蟹猴支持细胞后,分别以5%、10%、15%、20%4种不同血清浓度的培养基对食蟹猴支持细胞进行培养。利用MTT比色法判断支持细胞的增殖情况,从而确定最佳的血清培养浓度。[结果]5%血清浓度的培养基对细胞增殖能力的影响与10%血清浓度的培养基差异不显著,15%与20%的血清浓度的培养基对细胞增殖能力的影响差异不显著,5%、10%与15%、20%的血清浓度的培养基对细胞增殖能力的影响差异极显著。[结论]15%的血清浓度是支持细胞增殖的最佳比例。     

鸡胚垂体生长激素细胞的发生及其变化

为研究鸡胚垂体中生长激素细胞的发生及其在发育过程中的变化 ,分别在鸡胚发育的第 3 5～ 2 0 5天采集鸡胚垂体 ,用免疫组织化学方法研究鸡胚垂体中生长激素细胞的发生和细胞形态、数量、在垂体中的分布特点和在发育过程中的变化。结果表明 ,鸡胚发育中期第 9 5天可观察到少量的生长激素阳性细胞散在分布于垂体后叶 ,细胞多排列成索状或团状 ,细胞之间边界不清 ,细胞核较大。在鸡胚发育的第 12 5天以后 ,生长激素细胞的细胞浆与细胞核比值逐渐变小 ,且均匀分布于腺垂体的后叶。生长激素细胞数在鸡胚发育的第 12 5天之后显著升高 (P <0 0 1) ,在鸡胚发育的第 16 5天 ,生长激素细胞占垂体细胞总数的 9 4 %。以上结果证明鸡胚垂体中生长激素细胞增殖和分化过程主要发生在发育的中期至出壳之前 ,而生长激素细胞的分泌功能在鸡胚发育的后期最为活跃。     

Studies on Electrical Activation of Porcine Oocytes Matured in vitro and Embryo Culture Systems

Conditions for electrical parthenogenetic activation of porcine oocytes matured in vitro and in vitro culture systems of porcine embryo were studied. The best results were achieved under the conditions of electrical field strength and the pulse duration at 130Vmm-1/80 μs, with a blastocyst development rate of (20.12 ± 8.18)% (P ＞ 0.05). No significant difference was found between treatments of multiple pulses and a single pulse ( P ＞ 0.05). Parthenogenetic embryos were cultured with different methods and air conditions for 7 days in vitro, blastocyst development rate of embryos with changed culture media [ (26.44 ± 8.35)% ] or changed media with 10% fetal bovine serum (FBS) [ (17.68 ± 5.39)% ] on the fifth day showing no significant difference from that of embryos without change of culture media [ (25.30 ± 7.55) %, P ＞ 0.05 ], while cell numbers of blastocysts from embryos with changed culture media (15.78 ± 5.46 and 14.55 ± 4.81) were significantly lower than number of blastocysts from embryos without change of culture media (18.01 ± 6.79,P ＜ 0.01 ). Blastocyst development rate and blastocyst cell number of embryos cultured in lower O2 (5 % CO2:7%O2:88%N2) also showed no significant difference from those in high O2 (5% CO2 in air) [ (20.78 ± 8.80) % and 17.00 ± 6.12 vs. (25.30 ± 7.55) % and 18.01 ± 6.79, P ＞ 0.05 ]. It is concluded that change of culture media with the same new one or changing over to media with 10% fetal bovine serum (FBS) on the fifth day and low O2 environment are not necessary for porcine embryos development.     

氢化可的松对小鼠T淋巴细胞增殖的抑制作用

[目的]探讨氢化可的松对小鼠T淋巴细胞增殖功能的影响。[方法]用淋巴细胞分离液无菌制备小鼠脾淋巴细胞,于RPMI1640的完全培养基中加入ConA后进行转化。用流式细胞仪检测T细胞活化分子CD25和CD69及其共表达率。将转化的淋巴细胞分成不加氢化可的松的对照组和加入不同浓度的氢化可的松组,在各时间点取样计数,绘制其生长曲线。[结果]经ConA刺激3 d的T细胞上CD25和CD69分子及其共表达率最高,分别达73.5%、58%和32%。生长曲线显示,各组细胞在加氢化可的松后第2 d达到对数生长期,10-5、10-6、10-7mol/L浓度的氢化可的松对活化小鼠T淋巴细胞增殖都有抑制作用,但各浓度组间无显著差异（P〉0.05）,而与对照组相比有显著差异（P〈0.05）。[结论]在一定的浓度范围内氢化可的松对小鼠T淋巴细胞的增殖具有抑制作用,这为细胞移植免疫耐受的诱导提供了试验依据。     

SD大鼠睾丸支持细胞的分离、培养、纯化及鉴定

为进一步简化、优化SD大鼠睾丸支持细胞的体外培养条件及鉴定方法,采用三酶两步消化法和差异贴壁法分离、培养、纯化SD大鼠支持细胞,并用HE染色、油红染色、Feulgen染色及透射电镜扫描其超微结构予以鉴定。结果表明：平均0．10g睾丸组织可获得2．5×10^6个支持细胞,细胞存活率90％以上,体外培养5h后开始贴壁,96h后细胞生长速率下降,其对数生长期为3—7d,整个体外生长周期约为10～15d。对获得的纯化细胞进行鉴定,发现其形态结构及超微结构与支持细胞的形态特征一致。可见,采用三酶两步消化法和差异贴壁法,可达到分离、培养、纯化SD大鼠支持细胞的目的。     

花生根瘤菌的深层发酵培养研究

选择8种培养基进行振荡培养,从中选出YMA、YMA磷酸氢二铵、土壤浸出液、黄豆饼浸出液4种培养基进行深层发酵培养。在发酵条件控制在温度为28℃,pH值为7.0,溶氧量为90%以上的条件下,共培养5 d,定时取样测定其菌数并绘制生长曲线。结果表明,花生根瘤菌在上述4种培养基中的最大生物量分别为12.31亿,15.80亿,30.20亿,53.20亿个/ml;对数期的代时分别为9.112,9.053,9.086,8.933 h;生物量越大,对数期越长。     

山羊胎儿肌肉干细胞的分离培养与成肌诱导分化

【目的】通过体外建立安淮山羊胎儿肌肉干细胞分离培养及成肌诱导分化的方法,为进一步研究调控山羊肌肉干细胞增殖与分化的分子机制提供实验材料。【方法】本试验选取山羊胎儿背最长肌肌肉组织,用眼科剪剪成肉糜后,用0.1%的Ⅰ型胶原酶消化40 min,然后利用0.25%的胰酶消化15 min。分离得到的细胞用生长培养基（20%FBS+80%DMEM/F12+青链霉素）培养于37℃、5% CO2培养箱内。培养2h后采用差速贴壁技术对细胞进行纯化,又2h后,重复纯化一次。待细胞生长至70%左右密度时可进行传代培养。每次传代培养均采用差速贴壁30min的方法进一步纯化肌肉干细胞,共纯化至第6代。利用免疫荧光技术检测第6代细胞中肌肉干细胞标记基因Pax7、MyoD1的蛋白表达情况,从而对分离得到的细胞进行鉴定。当肌肉干细胞生长至70%左右密度时,将生长培养基更换为分化培养基（2%FBS+98%DMEM/F12+青链霉素）,诱导细胞向成肌方向分化并观察细胞的形态学变化。细胞诱导分化1d后,采用免疫荧光技术检测肌肉干细胞的分化标记基因Myog的蛋白表达情况。另外,分别提取诱导0、1、3、5、7d后的细胞的总RNA,通过反转录试剂盒反转成cDNA后,利用qPCR测定MyoD1和Myog的相对表达量。【结果】 分离得到的细胞呈贴壁生长,其形态趋于稳定后主要呈长梭形或纺锤形。免疫荧光技术检测的第6代细胞中Pax7和MyoD1蛋白均为阳性表达。采用分化培养基诱导细胞分化后,在显微镜下可观察到随着诱导天数的增加,细胞开始分化、相互融合成肌管且具有一定的方向性。免疫荧光检测结果表明Myog蛋白呈明显的阳性表达。另外,qPCR结果显示,标志基因MyoD1和Myog均有表达,且MyoD1的相对表达量在分化的第1天相比于0天显著升高并维持到第3天,第5、7天开始显著下降但仍显著高于增殖期。Myog在分化不同天数的细胞中的相对表达量具有类似的趋向。【结论】分离得到了纯度较高的安淮山羊胎儿肌肉干细胞,且诱导后展现出较好的成肌潜力。研究结果可为进一步开展肌肉干细胞成肌分化的分子机制研究提供材料来源。     

罗布麻悬浮细胞生长特性及产绿原酸的初探

[目的]探索罗布麻(Apocynum ventetum Linn.)悬浮细胞生长特性和产绿原酸量的最佳激素浓度,为进一步以罗布麻悬浮培养的细胞生产绿原酸奠定前期基础.[方法]以罗布麻悬浮细胞系为材,确定最佳接种量和细胞生长曲线,培养获得的材料经干燥、粉碎后经超声波法提取,以高效液相色谱法(HPIC)测定其中的绿原酸(CGA)量.以绿原酸量为指标,进行方差分析,确定最佳的植物生长调节剂的浓度.[结果]将罗布麻细胞悬液抽滤,以1.0 g(FW)/10 mL的接种量接种在MB(硝酸钾加倍,硝酸铵减半)+2.0 mg/L 2,4-D+0.05mg/L 6-BA+50g/L蔗糖(pH 5.9)培养基上,对数生长期为4～8 d.以上述接种量和5 d培养周期为条件,将获得的罗布麻细胞接种在不同NAA和KT浓度的培养基上培养,产绿原酸量最大的培养基为MB+0.3 mg/LNAA+0.3 mg/L KT+50g/L蔗糖(pH5.9),产量达0.183 mg/g(DW),与其它培养基相比在P=0.05水平上差异显著.[结论]通过罗布麻悬浮培养的细胞产绿原酸最佳培养基为MB+0.3 mg/L NAA+0.3 mg/L KT+50g/L蔗糖(pH5.9).     

激素对小鼠胚胎体外发育的影响

探讨小鼠胚胎体外发育过程中,2种激素(孕马血清促性腺激素PMSG、人绒毛膜促性腺激素HCG)对早期胚胎发育的影响。取原核期胚胎培养于不同的培养体系中,确定适合胚胎发育的最佳体外培养体系;在胚胎培养液中加入不同浓度的激素,观察激素对体外发育的影响。试验发现含10%胎牛血清的人输卵管液培养液(HTF)是该试验条件下小鼠早期胚胎发育的最佳培养液;在该培养液中添加不同浓度和不同种类的激素后,各发育阶段胚胎的发育率与未添加激素的对照组相比均有所下降,但未发现浓度依赖性。由此可认为,高浓度的PMSG和HCG对体外培养的胚胎发育有抑制作用,可降低胚胎发育到各阶段的比例,尤其是显著降低了囊胚的发生率。     

Study on in vitro Cultural Behaviors of Spermatogonium Stem Cells of New Born Calves

Three methods were adopted in culture spermatogoniums of newly born calf in vitro,such as enzymatic digestion and percoll density gradient centrifugation（MethodⅠ）,tubular fragments culture（MethodⅡ）and tissue culture（MethodⅢ）,and cultural behaviors of cells were observed.The results showed that typical spermatogonium colonies appeard at 144 h of culture by enzymatic digestion-percoll density gradient centrifugation method and tubular fragments culture method,2.5%FBS kept the characteristics of spermatogonium stem cell better than others,produced more mass clones,and FBS of more than 2.5%concentration benefited spermatogonium differentiation and the number of colonies was significantly affected by FBS concentration.After 1 week of culture in method Ⅲ,the diameter of lumens and quantity of sertoli’s cells in tubal wall increased obviously,lumen of seminiferous tubules appeared.Sertoli’s cells kept constant and the number of spermatogoniums decreased obviously after 2 weeks of culture.     

山羊胎儿成纤维细胞转染人t-PA指形区缺失基因及其核移植研究

采用阳离子脂质体法将人t-PA指形区缺失基因乳腺特异性表达载体(pEBT)导入山羊胎儿成纤维细胞,以山羊胎儿成纤维细胞和转染的山羊胎儿成纤维细胞作供体,构建核移植胚,对其体外发育情况进行了研究,比较了2种供体细胞(山羊胎儿成纤维细胞和转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞)及转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞饥饿处理与否对核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,早期核移植胚有荧光蛋白(GFP)的表达;以山羊胎儿成纤维细胞作供体细胞时,核移植胚的桑葚胚率(50.3%)及囊胚率(16.0%)均高于以转人t-PA指形区缺失基因胎儿成纤维细胞为供体时的桑葚胚率(48.4%)和囊胚率(10.9%),但差异不显著(P>0.05);转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞经饥饿处理后,其核移植胚胎的卵裂率(73.6%)与不饥饿时的卵裂率(73.9%)差异不显著;饥饿处理后核移植胚胎的桑葚胚率(48.5%)和囊胚率(11.2%)均高于不饥饿处理的桑葚胚率(39.2%)和囊胚率(9.2%),但差异不显著(P>0.05)。本研究成功地构建了转人t-PA指形区缺失基因的体细胞核移植胚胎,体外囊胚率为11.2%。