三七总皂甙对大黄鱼肾细胞生长及部分免疫相关基因表达的影响

本试验将三七总皂甙(PNS)体外作用于大黄鱼肾细胞,通过活细胞计数和荧光定量PCR检测,初步了解PNS对大黄鱼肾细胞生长及部分免疫相关因子表达的影响。结果显示,40~200μg/mL浓度的PNS对大黄鱼肾细胞生长无明显影响,但浓度达到1 mg/mL以上时,对细胞生长有负面影响;10~1 000μg/mL浓度的PNS对大黄鱼肾细胞Toll样受体5mRNA的表达有一定的上调作用,但对Toll样受体3的表达有一定的下调作用;PNS浓度为10~100μg/mL时对大黄鱼肾细胞碱性磷酸酶的表达无明显影响,但浓度达到1 000μg/mL时对该因子的表达有下调作用;PNS浓度为10μg/mL时对大黄鱼肾细胞溶菌酶的表达无明显影响,但浓度达到100μg/mL以上时对该因子的表达具有一定的下调作用。     

猪链球菌2型PCR-ELISA检测方法的建立与优化

根据已发表的猪链球菌2型的cps2j基因序列,设计合成上游标记生物素的1对引物和1条标记地高辛的特异性探针,建立了该菌的PCR-ELISA检测方法。方法利用PCR仪作为杂交场所,并对几个主要条件参数进行优化,结果显示在鲑鱼精DNA浓度1.6mg·mL-1、变性温度为94℃、变性时间为1min、探针浓度为0.5umol·mL-1、杂交温度55℃、杂交时间1min、一抗作用时间45min、二抗作用时间40min时检测方法敏感性最好,特异性最强。通过对17个阴性样本检测,测得平均值为0.057,方差为0.047,计算得临界值为0.198。     

刺激隐核虫抑动抗原生物学信息及抗原特性分析

对刺激隐核虫抑动抗原基因进行生物学信息分析,利用抗原表位多肽制备了鼠源抗抑动抗原抗体,并研究其抗原特性.试验结果表明：利用表位串联多肽所制备的鼠源抗抑动抗原抗体包含有针对刺激隐核虫抑动抗原的特异性抗体,为刺激隐核虫单克隆抗体和疫苗的制备奠定了基础.     

刺激隐核虫在褐牙鲆上的传代及其生活史观察

为保存从福建省长乐市褐牙鲆上分离的刺激隐核虫、并了解其生物学特性、以褐牙鲆为宿主鱼、在水温 22~24益时、对刺激隐核虫进行传代、详细观察其生活史及各阶段的形态结构、比较不同温度处理的包囊孵化率和孵 出幼虫的感染能力、分别采集感染后2 周和4 周的褐牙鲆血清做阻动试验。目前已成功进行了40 个周期的刺激隐 核虫传代保种、每个周期8~10 d、表明褐牙鲆可作为刺激隐核虫的模式宿主鱼。观察包囊的形态结构、发现少数包囊 中存在疑似滋养体并做旋转运动的圆形原生质体。包囊5益冷藏2 个月后刺激隐核虫的孵化率下降至7.6 %、用 1 000 个5益冷藏后孵化的幼虫感染褐牙鲆、未检出滋养体。免疫血清阻动试验表明、感染后2 周和4 周的褐牙鲆血 清对幼虫的阻动效价分别为1颐320 和1颐1 280、说明体液免疫在抵抗刺激隐核虫的感染中发挥了重要作用。     

刺激隐核虫幼虫膜蛋白单克隆抗体的制备与特性分析

为获得刺激隐核虫幼虫膜蛋白单克隆抗体并初步分析单抗特性,提取刺激隐核虫幼虫膜蛋白,免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/O细胞融合,以间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞。通过ELISA方法检测单克隆抗体的亚类及效价;通过SDS-PAGE和western blot分析单抗特异性结合的蛋白,并以串联质谱方法对所识别条带进行鉴定;采用免疫荧光法分析单抗的抗原结合位点和特异性。结果得到3株能稳定分泌刺激隐核虫幼虫膜蛋白抗体的细胞株(5D11AG5、5H9BG3、6E11CE7)。这3株细胞株产生的抗体亚型均为IgM,ELISA效价分别为1∶3200、1∶25600、1∶51200。单抗5D11AG5和单抗5H9BG3株能够识别~35kDa的刺激隐核虫幼虫膜蛋白线性抗原表位,单抗5D11AG5所识别的蛋白与数据库中刺激隐核虫表面抗原蛋白、嗜热四膜虫微管蛋白(tubulin)的肽段具有较高覆盖率。免疫荧光结果显示单抗5D11AG5和单抗5H9DG3识别部位主要在虫体表面近胞口的前端,而单抗6E11CE7识别虫体表面外膜。刺激隐核虫幼虫膜蛋白单克隆抗体的制备,为刺激隐核虫功能性蛋白的筛选、纯化和功能分析提供了条件。     

迟钝爱德华菌PuAH基因的原核表达及其部分特性分析

本试验旨在对迟钝爱德华菌EIB202 PuAH基因进行克隆表达,并对其部分特性进行分析。根据GenBank中发表的迟钝爱德华菌PuAH基因序列(登录号:CP001135,CDS编号:ETAE_0818)设计引物,克隆并通过表达载体pET32a重组表达该基因所编码的蛋白,纯化表达产物并制备兔抗血清,采用ELISA、Western blotting、溶血试验、菌体凝集试验分析所得融合蛋白的特性。结果显示,所得融合蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达,蛋白分子质量约为42 ku;具有免疫原性和抗原性,对鳗鲡红细胞不具溶血性,但融合蛋白抗血清对迟钝爱德华菌EIB202膜蛋白提取物的溶血性有一定的抑制作用,且可以凝集迟钝爱德华菌EIB202菌体。     

大黄鱼肿大细胞病毒不同毒株的细胞培养及主要衣壳蛋白基因比较

为建立大黄鱼肿大细胞病毒的培养方法,明确其分类地位,用肿大细胞病毒检测呈阳性的大黄鱼幼鱼病料 (FD201807和SA201808)肾组织匀浆液感染鳜仔鱼细胞系 (mandarin fish fry cell line-1,MFF-1)并连续传代,从病料组织匀浆液和细胞冻融液中提取病毒DNA,克隆病毒主要衣壳蛋白基因 (mcp),测序后与NCBI GenBank中的虹彩病毒科肿大细胞病毒属病毒mcp以及2018—2020年所检出的15株大黄鱼肿大细胞病毒mcp进行比对分析。结果显示,病毒传至第4代才可引起MFF-1细胞病变,细胞病变的主要特征为细胞脱壁、变圆、折光度增强;感染时间越长脱壁细胞越多,同时培养液中的颗粒增加;透射电镜下可见感染细胞的细胞质散在大小为130~150 nm的六边形病毒粒子和空壳。感染细胞的病变周期随传代代次的增加而缩短,第15代次的FD201807株感染细胞80%细胞病变的时间为3 d,第15代次的SA201808株感染细胞80%细胞病变的时间为7~8 d。mcp序列比对和聚类分析发现,SA201808株与FD201807株的mcp序列存在21个碱基差异,二者的mcp序列分别与大黄鱼虹彩病毒(large yellow croaker iridovirus, LYCIV) LYCIV-Zhoushan (GenBank: MW139932.1)和花鲈虹彩病毒 (Lateolabrax maculatus iridovirus, LMIV) (GenBank: MH577517.1)相近。15株从大黄鱼病料检出的肿大细胞病毒中,12株的mcp序列与SA201808株聚类;3株与FD201807聚类。本研究利用MFF-1细胞系分离培养了大黄鱼肿大细胞病毒,揭示了大黄鱼肿大细胞病毒存在差异,为更好地了解大黄鱼肿大细胞病毒提供了数据参考。     

创伤弧菌浸泡感染对孔雀鱼的影响

为建立创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的感染模型,了解创伤弧菌对孔雀鱼(Poecilia reticulate)的致病力以及创伤弧菌感染对孔雀鱼免疫相关因子表达的影响。将孔雀鱼分为4组,分别以创伤弧菌FZ03-5X浓度为3.3×108、3.3×107、3.3×106和0 CFU/mL的菌液浸泡感染5 h,检测感染15 d后3.3×107CFU/mL浸泡组和生理盐水对照组鳃免疫相关因子和凋亡相关因子的表达水平。结果表明,4个浓度组孔雀鱼的死亡率分别为40%、18.33%、13.33%和6.67%。感染15 d后,肿瘤坏死因子(TNF)、Mx因子、与细胞凋亡相关的凋亡因子FAS和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)的表达水平显著高于生理盐水对照组(P0.05)。试验结果说明,创伤弧菌可通过浸泡的方式使孔雀鱼致病,孔雀鱼因创伤弧菌感染产生的炎症反应可持续15 d。     

口服三七总皂甙对大黄鱼免疫功能的影响

将含不同浓度三七总皂甙(PNS)的饲料(0、10、50、250 mg·kg^-1)连续14 d投喂大黄鱼,检测肝、脾、头肾组织部分免疫相关基因的表达,以及血清部分免疫因子的活性,结合人工注射感染变形假单胞菌的抵抗力,评估口服PNS对大黄鱼免疫功能的影响。实验结果显示,各浓度组大黄鱼血清超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LZM)、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(ALP)活性与对照组相比无显著差异;高浓度组(250 mg·kg^-1)大黄鱼脾组织粘病毒抗性蛋白(Mx)的相对表达水平显著高于对照组,中浓度组(50 mg·kg^-1)脾组织和低浓度组(10 mg·kg^-1)头肾组织的Mx相对表达水平略高于对照组,但差异不显著;各浓度组各组织肿瘤坏死因子α链(TNF-α)的相对表达水平与对照组无显著差异,但均低于对照组;各浓度组各组织中白细胞介素10(IL-10)和主要组织相容性复合体Ⅱ类α链(MHCⅡ-α)的相对表达水平与对照组无显著差异。感染变形假单胞菌后各浓度组大黄鱼的死亡率与对照组无显著差异。结果表明,饲料中添加10~250 mg·kg^-1的PNS连续投喂14 d未能明显增强大黄鱼免疫机能。     

嗜热四膜虫表达载体的优化

近年来淡水纤毛虫嗜热四膜虫成为新的重组亚单位疫苗生产平台。为了进一步提高重组四膜虫的筛选效率,使其能更广泛地应用于重组亚单位疫苗制备,本研究利用基因工程手段,改造了原有的表达载体,把带有巴龙霉素抗性的neo基因换成嘌呤霉素抗性表达盒,从而提高重组四膜虫的筛选效率,达到优化表达载体的目的,同时将常用的氯化镉诱导的MTT1启动子替换成HSP70启动子,实现热诱导表达,为嗜热四膜虫表达平台在重组亚单位疫苗的进一步应用奠定基础。