青虾源维氏气单胞菌胞外产物生物学特性及蛋白成分分析

为了研究维氏气单胞菌胞外产物在青虾感染中的致病作用以及维氏气单胞菌的致病机理,本试验以青虾源维氏气单胞菌QXF0711B为研究对象,提取其胞外产物,采用打孔法测定其胞外产物的酶活性,并对溶血活性进行溶血谱分析,同时分析其致病性。应用液相质谱与串联质谱相结合方法(LC-MSMS)对其胞外产物蛋白成分进行鉴定,利用Gene Ontology(GO)对已鉴定蛋白进行生物学过程、分子功能和细胞组分的分类分析。结果表明:QXF0711B菌株胞外产物具有淀粉酶活性、脂肪酶活性、蛋白酶活性和溶血活性,不具有明胶酶活性;其可溶解多种动物红细胞,尤以对鱼类红细胞溶血性更强,但对鸡、鸭红细胞无溶血活性。通过对菌株胞外产物蛋白成分分析显示有90种蛋白:共参与45种生物学过程,主要涉及碳水化合物代谢过程、运输等;共有46种分子功能,主要涉及DNA结合、ATP结合、金属离子结合等;为12种细胞组分,主要包括膜的有机组成、细胞质、细胞外膜等。     

副鸡禽杆菌A、B、C 3个血清型菌株外膜蛋白的差异分析

为了探索不同血清型副鸡禽杆菌菌株外膜蛋白的差异,本试验采用FOCUSTM Global Fractionation试剂盒制备副鸡禽杆菌A(221株)、B(0222株)、C(Modesto株)3个血清型参考菌株的外膜蛋白,进行SDS-PAGE凝胶电泳。结果表明,不同血清型参考菌株的电泳图谱相似,经凝胶定量软件分析,结果显示,主要条带均有7个,其分子质量相似,分别占A、B和C蛋白质总量的70.85%、68.6%和65.71%。此外共有3个蛋白质条带分子质量相似,但蛋白质含量差异显著(P<0.05)。本试验为副鸡禽杆菌外膜蛋白的进一步研究提供了理论依据。     

广东省猪大肠杆菌优势血清型O107外膜蛋白的提取

实验室从广东省鉴定的猪大肠杆菌优势血清型O₁₀₇中,选出一株有致病性菌株。通过细菌培养、超声波裂解、N—十二烷基肌氨酸钠处理和超速离心技术提取出大肠杆菌O₁₀₇的外膜蛋白。提取物经SDS—PAGE电泳检测后发现蛋白条带大小与预期的实验结果相同。     

嗜水气单胞菌弹性蛋白酶基因的克隆表达

为了研究嗜水气单胞菌重组弹性蛋白酶的酶学性质,试验根据GenBank中的嗜水气单胞菌弹性蛋白酶基因ahyB设计1对含酶切位点的特异引物,以嗜水气单胞菌J-1(AhJ-1)株为模板,经PCR扩增得到不含信号肽的成熟弹性蛋白酶基因片段(787 bp),并与pMD18-T载体连接、测序,再用DNAStar软件分析。结果表明:该基因片段与豚鼠气单胞菌胞外蛋白酶同源性高达95%,与嗜水气单胞菌AG2株弹性蛋白酶ahyB基因同源性为92%,与铜绿假单胞菌LasB基因同源性为82%;将PCR产物连入表达载体pET-32a,转化至大肠杆菌BL21菌株中进行诱导表达,出现50 ku的融合表达蛋白,该表达产物纯化复性后表现出酶的活性。     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白表型分析

为揭示副猪嗜血杆菌外膜蛋白与毒力的关系,采用SDS-PAGE测定了82个副猪嗜血杆菌分离株细胞外膜蛋白(OMP),比较了不同临床背景分离株的OMP表型差异,根据外膜蛋白的电泳迁移率Rf值和蛋白含量对OMP与毒力菌株的相关性和PAGE分型进行了聚类分析。图谱表型分析结果表明,82个分离株分成以相对分子质量36～40ku为特征的Ⅰ型和以42～45ku为特征的Ⅱ型2种类型,约34%患病猪分离株属于PAGEⅠ型,只有8.7%健康猪分离株属于PAGEⅠ型。Rf值聚类分析结果显示外膜蛋白分为3种类型,PAGEⅠ、PAGEⅡ和PAGEⅢ型。图谱蛋白含量聚类分析显示5个PAGE型。结果提示,36～40ku蛋白与菌株的毒力相关。     

天津地区部分猪源大肠杆菌的OMP型

从天津各区主要养猪场分离的16株（7种血清型O20，O21，O139，O141，O93，O108，O147）大肠杆菌中提取外膜蛋白（OMP），经SDS－PAGE分析表明，5株O21菌株有2个OMP型（OMP－1和OMP－3型），3株130菌株和3株O20菌株各出现2个OMP型（OMP－1和OMP－2型），2株O141菌株共出现2个OMP型（OMP－2和OMP－3）。1株O93菌株，1株O108菌株和1株O147菌株均为OMP－1型，结果表明，相同血清型的菌株可以有不同的OMP型，不同血清型的菌株可以有相同的OMP型。     

用SDS—PAGE分析鸡毒霉形体广西分离株的结构蛋白

应用SDS－PAGE对鸡毒霉形体（Mycoplasma gallisepticum,MG)4个标准株和5个广西分离株的结构蛋白进行了比较分析。结果，在凝胶电泳图谱中10－100ku蛋白分子质量之间，F株缺少87ku蛋白带，Y3株在最靠近87ku蛋白带的上方和下方各缺少1条蛋白带，H2株和Y2株缺少64ku蛋白带，CH株缺少29ku蛋白带，97、75、43ku处的蛋白带为4个MG标准株和5个MG分离株所共有。表明9个MG供试菌株的结构蛋白都存在一定的差异，广西MG分离株的结构蛋白呈现多样性。     

乌鳢源维氏气单胞菌胞外产物的生物学活性分析

为研究维氏气单胞菌胞外产物在乌鳢感染中的致病作用以及维氏气单胞菌的致病机理,以乌鳢源维氏气单胞菌WL161为研究对象,提取其胞外产物,采用打孔法测定其胞外产物的酶活性,并对与毒力密切相关的溶血活性进行进一步的溶血谱研究,同时分析其致病性。应用LCMSMS方法对其胞外产物蛋白成分进行鉴定,利用Gene Ontology(GO)对已鉴定蛋白进行生物学过程、分子功能和细胞组分的分类分析。结果表明,WL161菌株具有淀粉酶活性、脂肪酶活性、蛋白酶活性和溶血活性,不具有明胶酶活性;ECP对其他多种动物红细胞均有溶血活性,对鱼类红细胞溶血性较强,但对鸡红细胞无溶血活性。其胞外产物共检测出118种蛋白,共参与40种生物学过程,主要涉及碳水化合物代谢过程、几丁质分解代谢过程、DNA结合等;69种分子功能主要涉及ATP结合、金属离子结合、碳水化合物结合等;19种细胞组分主要包括胞外区、细胞质、细胞外膜等。     

停乳链球菌MIG基因的克隆和原核表达

本研究用PCR方法从停乳链球菌C588的基因组DNA中扩增出MIG基因，用T／A克隆法将其插入pBS—T载体，并构建原核表达载体pET-32a（＋）-MIG。用BL21（DE3）／pET系统表达Trix—MIG融合蛋白，SDS—PAGE和Westem blot分析鉴定表达产物。结果PCR扩增产物经测序，证实与GenBank中停乳链球菌MIG基因（AF354651）序列同源性为99％。SDS—PAGE显示，经IPTG诱导后BL21（DE3）／pET-32a（＋）-MIG总蛋白中出现一条相对分子质量为89ku的新蛋白条带。Westem blot分析显示，MIG蛋白可与停乳链球菌多克隆抗血清发生特异性反应。MIG融合蛋白的表达为MIG在细菌致病中的作用研究以及相关疫苗的制备奠定了基础。     

维氏气单胞菌TH0426胞外产物酶活性及免疫原性分析

为研究维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)胞外产物的合成及其功能,本试验采用超滤浓缩法提取Aeromonasveronii TH0426的胞外产物,通过平板琼脂扩散法对其主要酶成分进行初步研究,对蛋白酶、脂酶、卵磷脂酶、淀粉酶、脲酶、明胶酶和溶血活性进行测定,对斑马鱼腹腔注射胞外产物测定其致病性,并对其免疫原性进行初步分析。结果显示,菌株胞外产物具有脂酶、淀粉酶、蛋白酶和溶血活性,人工感染试验结果表明,菌株胞外产物对斑马鱼具有致病性,其半数致死量为3.355 0μg/条。SDS-PAGE表明,ECP由19条蛋白带组成,利用鲤鱼抗ECP血清进行Western blot显示,组成ECP的19条蛋白带中有5条具有免疫原性,能够引发机体的免疫应答反应产生抗体,其相对分子质量为别为110 000,47 000,45 000,42 000和38 000,为Aeromonasveronii胞外产物亚单位疫苗的研制与开发提供理论依据。     

荣昌猪白细胞介素15成熟肽基因的克隆、表达及其表达产物活性检测

运用RT—PCR技术从由刀豆蛋白（ConA）诱导培养的荣昌猪外周血淋巴细胞（PBMC）扩增出猪白细胞介素15（pIL-15）完整开放阅读框（ORF），共489bp，编码162aa。与已公布的2个猪IL-15基因核苷酸同源性均为99．4％。分子进化分析表明其与人及哺乳动物IL-15基因的进化关系较近，而与鸡的IL-15基因进化距离较远。运用PCR技术从含荣昌猪IL-15开放阅读框序列质粒中扩增其成熟蛋白编码基因，共345bp。将其定向克隆于原核表达载体pET-32a（＋）后在E．coli BL21中诱导表达，SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白约为34ku，重组蛋白以包涵体形式表达，表达产物约占菌体总蛋白的38．7％；Western blot分析表明，在相对分子质量34ku处有一条特异性带；对诱导重组菌进行转录检测得到约356bp的特异性片段。MTT法试验证实，表达产物初步纯化、透析复性后，可明显增强淋巴细胞的增殖。荣昌猪IL-15成熟肽成功在体外表达，获得的高效表达的产物具有一定的生物学活性。     

绵羊精浆蛋白质组2-DE图谱的构建及初步分析

本研究比较了丙酮沉淀法制备蛋白质不同上样量对绵羊精浆蛋白质二维电泳图谱的影响。结果显示,精浆总蛋白经SDS-PAGE电泳,得到分子质量在14.4~116 ku的28条蛋白质条带。二维电泳图经PDQuest 8.0分析,上样量为0.8、1.0、1.2 mg时检测出的蛋白质点分别为207±10、281±13和374±16个,分子质量基本分布在20~80 ku、等电点为4~9的区域内,随着上样量的增加,分子质量在20~80 ku的蛋白质点明显增多,但每个分子质量区间的蛋白质点所占的比率较为恒定。研究结果表明,采丙酮沉淀制备精浆蛋白结合合适的上样量能够建立绵羊精浆全蛋白质图谱,为进一步研究绵羊精浆蛋白质组学奠定基础。     

Molecular and genetic comparisons of two serotypes of epizootic hemorrhagic disease of deer virus

The virus-specific double-stranded genome RNA of 2 serotypes of epizootic hemorrhagic disease of deer virus (EHDV) was evaluated by use of coelectrophoresis in polyacrylamide and agarose gel systems. The molecular weights of virion RNA segments were 0.32 to 2.57 X 10(6) for EHDV-1 and 0.33 to 2.54 X 10(6) for EHDV-2. Seven of 10 double-stranded RNA segments of the 2 serotypes had different electrophoretic mobilities in the polyacrylamide-gel electrophoresis system. Although the individual RNA segments of each serotype contained unique RNA sequences determined on the basis of 2-dimensional polyacrylamide-gel electrophoresis analysis of oligonucleotides, the corresponding segments of the 2 serotypes were found to be comparable and at least 1 pair of RNA segment was almost identical. Virus-specific polypeptides for the 2 serotypes were compared by use of gel electrophoresis. Eleven polypeptides were detected for EHDV-1 and 10 for EHDV-2. Six corresponding polypeptides of these 2 serotypes had different electrophoretic mobilities, indicating that these corresponding polypeptides differ in their molecular weights. A genetic relationship was not determined between the 2 EHDV serogroups and the blue-tongue serogroup viruses, using oligonucleotides mapping.     

Expression and antigenic characterization of the major core protein VP7 of Chuzan virus, a member of the Palyam serogroup orbiviruses

The Palyam serogroup-specific antigen, VP7, of Chuzan virus strain K-47 was expressed in insect cells by a recombinant baculovirus. The expressed protein appeared as a single band of 38kDa corresponding to the predicted molecular mass of Chuzan virus VP7 by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In immunoprecipitation analysis, the recombinant VP7 was not only recognized by all polyclonal antibodies against the Palyam serogroup viruses (PALV) tested in this study, but also by antisera to bluetongue virus (BTV) serotype 1, epizootic haemorrhagic disease virus (EHDV) serotypes 1 and 2. However, in Western immunoblot assay, no positive signals were observed between this protein and these antisera, even in the homologous reaction using antiserum to Chuzan virus. These findings demonstrate that the common antigenic determinants on the VP7 proteins of Chuzan virus and the other PALV serotypes are mainly conformational and that the proteins share some epitopes with those of BTV and EHDV beyond the serogroup. No cross-reactivities were detected between Chuzan virus VP7 and antisera to BTV and EHDV in agar gel immunodiffusion (AGID) and indirect ELISA tests, indicating that the recombinant VP7 is useful as a diagnostic reagent for serological tests of congenital abnormalities of cattle caused by PALV.     

嗜水气单胞菌J-1株外膜蛋白Omp38的抗原性分析

根据GenBank已发表的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)外膜蛋白Omp38的基因序列设计引物,以Ah J-1株基因组为模板,扩增omp38基因片段,定向克隆至表达质粒pET32 a中,将重组原核表达质粒pET32 a-omp38转化至大肠杆菌BL21,诱导表达出分子量约35 ku的重组蛋白。用纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,ELISA检测抗体效价为1∶25 600,表明该蛋白有良好的免疫原性。PCR检测表明,omp38基因可在73%(22/30)的嗜水气单胞菌中发现。重组蛋白抗血清与30株嗜水气单胞菌分离株进行凝集试验,所有分离株均可在不同程度上发生反应,表明该重组蛋白是一种潜在的共同保护性抗原,可作为基因工程亚单位疫苗的候选成分。     

猪胸膜肺炎调查及地方适用型灭活疫苗的研制

对广东珠江三角洲地区31个猪场450份血清用IHA方法进行猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)抗体检查,阳性猪场和阳性血清分别为96.8%和58.4%;分离鉴定了7株APP,血清分型为1、7、3和4型,且以1、7型毒力较强;用平板凝集法对263份APP抗体阳性血清进行抗体反向分型试验,结果1型、7型共占76.4%。确定了APP最佳液体培养条件,培养菌液CFU为2.4×109/mL;研制的APP 1型、7型二价灭活疫苗安全、稳定。兔和仔猪免疫抗体曲线显示,油乳剂疫苗明显优于铝胶疫苗,二次免疫优于一次免疫;APP双价油乳剂灭活疫苗一次免疫仔猪,能100%抵抗APP同源1、7型强毒菌株的攻击,保护期达110 d;田间试验明显提高猪群的生产成绩。     

草地藏系绵羊乳的组成及乳蛋白多态性

测定了63只草地藏系绵羊乳常规营养成分的含量,并用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了乳蛋白组分及乳蛋白多态性。结果表明:草地藏系绵羊脱脂乳中蛋白含量为(48.45±1.66)g/L,乳糖含量为(41.93±0.64)g/L,乳脂肪含量为(69.43±1.44)g/L;脱脂乳蛋白主要包括α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、酪蛋白、免疫球蛋白等组分,酪蛋白的相对含量约为52%。乳中酪蛋白、β-乳球蛋白均未检测到多态性。试验检测到4种分子量类型的乳上皮粘蛋白(MUC1),分子量分别为214、209、207和205 ku。试验结果提示,草地藏系绵羊乳蛋白多态性较为贫乏。     

C型口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及重组蛋白的纯化

利用PCR技术扩增获得C型口蹄疫病毒VP1基因,将其克隆到原核表达载体pET-30α(+)上,构建重组表达质粒pET-VP1。质粒pET-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导VP1基因的表达,收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE、Western blot分析,结果得到分子量约为33 ku的目的条带,表达产物占菌体总蛋白的35%,且该目的条带能被C型FMDV阳性血清识别,说明VP1基因在大肠杆菌中得到高效表达。融合表达蛋白经镍柱纯化,重组蛋白纯度达90%以上。     

嗜水气单胞菌分离株ERIC-PCR及RAPD分型比较

采用ERIC-PCR和RAPD 2种方法对嗜水气单胞菌2009年分离菌株及实验室保存菌株共83株进行分子分型。参考相关文献设计并合成引物,分别进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳,电泳结果经Quantity One软件数值化后利用SPSS软件进行聚类分析。结果显示,除少数分离株外,使用2种方法对大多数菌株分型,均能得到多态性较好的指纹图谱。RAPD的AP12H引物能扩增出1～12个200～4 500bp之间的条带,可将嗜水气单胞菌分离株分为4群、12类。ERIC-PCR能扩增出4～16个100～5 800bp之间的条带,将嗜水气单胞菌分离株分为4群、17类,同一年代、同一地域分离株分别有聚成一类的趋势。2种分型方法均体现很好的分型能力。但ERIC-PCR分型与RAPD分型相比,重复性和稳定性更好,分辨力更高,且具备RAPD不要求模板序列已知而直接进行扩增的优点,更适合嗜水气单胞菌的分型研究。     

日粮蛋白质来源对早期断奶仔猪胃内消化酶活性的影响

本试验将95头新生迪卡小公猪随机分为4组,第1、2、3组每组19头,均由两头经产母猪哺乳喂养,21日龄断奶。第4组仔猪38头,由4头经产母猪哺乳喂养,35日龄断奶。7日龄起至35日龄各组仔猪分别饲喂不同蛋白质来源的日粮。试验各组仔猪在24、28和35日龄进行屠宰试验,取胃内样品进行酶活性测定。试验结果表明:21日龄断奶使仔猪胃内蛋白酶、脂肪酶活性显著降低,酶活性在1周内不能得到完全恢复,胃蛋白酶活性可在断奶后2周得到恢复;全植物性蛋白日粮使早期断奶仔猪胃内蛋白酶和脂肪酶活性显著降低;日粮中加一定量乳清粉和动物性蛋白质饲料能有效提高胃蛋白酶和脂肪酶的活性。因此,断奶及日粮蛋白质来源显著影响早期断奶仔猪胃内消化酶活性。