奶样中无乳链球菌和乳房链球菌的分离与鉴定

奶牛乳房炎是奶牛最常见的疾病之一.该病主要由细菌引起,在牛群中广泛存在,其中无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)和乳房链球菌(Streptococcus uberis)是奶牛乳房炎主要的致病性链球菌.试验采用THB(Todd-Hewitt Broth)固体选择性培养基和色素试验培养基快速分离无乳链球菌和乳房链球菌,并结合生物梅里埃开发的VITEK全自动细菌鉴定仪进行准确鉴定,从而建立一种从奶样中快速分离无乳链球菌和乳房链球菌的常规方法.     

无乳链球菌SIP基因的克隆和原核表达

目的重组表达无乳链球菌表面免疫相关蛋白(Surface immunogenic protein,SIP)基因,为进一步免疫学研究提供目标蛋白.方法用PCR的方法从石河子分离株的基因组DNA中扩增出SIP基因,用T/A克隆法将其插入PBST载体,并构建原核表达载体pET-32a( )-SIP.用BL21(DE3)/pET系统表达Trix-SIP融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物.结果PCR扩增产物经测序,证实与GenBank中无乳链球菌(DQ650634)的SIP的基因序列同源性为98.62%.SDS-PAGE显示,经IPTG诱导后BL21(DE3)/pET-32a( )-SIP总蛋白中出现一条相对分子质量为71KDa的新蛋白带.West-ern blot分析显示,SIP蛋白可与无乳链球菌多克隆抗血清发生特异性反应.结论已成功表达SIP,为SIP在细菌致病中的作用研究以及相关疫苗的制备奠定了基础.     

停乳链球菌MIG基因的克隆和原核表达

本研究用PCR方法从停乳链球菌C588的基因组DNA中扩增出MIG基因，用T／A克隆法将其插入pBS—T载体，并构建原核表达载体pET-32a（＋）-MIG。用BL21（DE3）／pET系统表达Trix—MIG融合蛋白，SDS—PAGE和Westem blot分析鉴定表达产物。结果PCR扩增产物经测序，证实与GenBank中停乳链球菌MIG基因（AF354651）序列同源性为99％。SDS—PAGE显示，经IPTG诱导后BL21（DE3）／pET-32a（＋）-MIG总蛋白中出现一条相对分子质量为89ku的新蛋白条带。Westem blot分析显示，MIG蛋白可与停乳链球菌多克隆抗血清发生特异性反应。MIG融合蛋白的表达为MIG在细菌致病中的作用研究以及相关疫苗的制备奠定了基础。     

牛源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分离鉴定

从奶牛分离得到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methieillin—resistant Staphylococcus aureus,MRSA）。按常规方法复苏菌株,用血浆凝固酶试验鉴定SA。用KB法、琼脂筛选法、生化鉴定法（VITEK32）、聚合酶链反应等鉴定MRSA。常规分离鏊定的葡萄球菌468株,其中凝固酶阴性葡萄球菌（coagulase negative Staphylococcus,CNS）361株,检出率为77．149,6,金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,SA）105株,检出率为22．44％,MRSA36株检出率为34．29％,2株未定型,占0．42％。而MRSA在乳房炎奶样中检出率高达34．29％,表明新疆兵团部分垦区牛场MRSA已经呈蔓延趋势。     

奶牛无乳链球菌疫苗的研究进展

无乳链球菌是奶牛乳房炎最常见的病原体之一,其所致感染率高,给治疗带来了极大困难。疫苗是预防无乳链球菌感染的有效手段,但是无乳链球菌的血清型比较多,给疫苗设计带来非常大的困难。随着现代分子生物学技术的发展,应用基因工程技术重组表达来获取高纯度保护性抗原重组蛋白作为疫苗,是一个很好的发展方向。文中对近年来关于无乳链球菌在此方面的研究做一综述。     

乳房链球菌GAPC基因的克隆及原核表达

为了重组表达乳房链球菌表面脱氢酶GAPC基因,为免疫学研究提供目标蛋白,用PCR方法从石河子分离株的基因组DNA中扩增出GAPC基因,用T/A克隆法将其插入PBST载体,并构建原核表达载体pET-32a（＋）-GAPC。用BL21（DE3）/pET系统表达Trix-GAPC融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物。结果表明,PCR扩增产物经测序,证实与GenBank中乳房链球菌（AF421900.1）GAPC的基因序列同源性为99%。SDS-PAGE显示,经IPTG诱导后BL21（DE3）/pET-32a（＋）-GAP总蛋白中出现一条分子质量为55ku的新蛋白带。Western blot分析显示,GAPC蛋白可与乳房链球菌多克隆抗血清发生特异性反应。该研究已成功表达了GAPC,为GAPC在细菌致病中作用的研究以及相关疫苗的制备奠定了基础。