猪6种常见病毒多重PCR检测方法的建立及应用

旨在建立一种可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)和猪巨细胞病毒(PCMV)的多重PCR检测方法。参考相关文献及序列比对结果设计6对特异性引物,建立了可同时检测以上6种病毒的多重PCR方法并应用此方法对临床病例进行了检测。结果表明,所建立的多重PCR方法灵敏度高,对6种病毒的最低核酸检测量分别为12.8pg(PRRSV)、46pg(CSFV)、16pg(PRV)、23.5pg(PCV-2)、72pg(PPV)、8.6pg(PCMV),对猪流感病毒(SIV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)无特异性扩增。应用该方法对临床145份样品进行检测,总阳性率为83.45%,2种以上病毒混合感染阳性率为69.66%。说明所建立的多重PCR检测方法敏感,可用于猪群中上述6种猪病病原的单一感染或混合感染的鉴别诊断。     

检测PRV野毒株、PCV-2及PPV多重PCR方法的建立及初步应用

根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2、猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,设计了3对引物,成功建立了检测PRV野毒株、PCV-2和PPV的多重PCR诊断方法,扩增产物分别为288 bp、419 bp、681 bp。敏感性、特异性试验结果显示,该PCR对3种病毒的最低核酸检测量分别为PRV 48.2 pg/L、PCV-2 36.7 pg/L、PPV 0.25 ng/L,而PRV(gE基因缺失株)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。对87份自然感染病猪样品的检测结果表明,该多重PCR检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明,该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株、PCV-2和PPV的检测。     

基于多重PCR的寡核苷酸基因芯片检测猪瘟病毒,猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒及猪圆环病毒1型和2型

为了建立一种可同时检测区分猪瘟病毒(CSFV),猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的寡核苷酸基因芯片方法,本研究针对每种病毒设计了4条～6条寡核苷酸探针,检测低限为1.6×104PCV-2拷贝数/μL,1.6×104CSFV拷贝数/μL,1.6×105PRRSV拷贝数/μL,比琼脂糖凝胶灵敏约10倍。利用建立的寡核苷酸基因芯片方法对76个仔猪样本进行了检测,检出了3种病毒的存在,其中25个样本(32.9%)同时感染了2种以上病毒。结果表明寡核苷酸基因芯片检测是一种快速、灵敏和高效的猪只混合感染病毒的病原学诊断方法。     

猪重要病毒性病原多重PCR检测方法建立及应用

本试验针对当前对养猪业危害严重的猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV),分别建立了检测CSFV和PRRSV的双重RT-PCR方法和检测PCV2、PRV及PPV的多重PCR方法。所建立的方法对CSFV、PRRSV、PCV2、PRV和PPV核酸的检出量分别为7.5 pg/μL、14.2 pg/μL、6.9 pg/μL、9.2 pg/μL和8.6 pg/μL。应用建立的方法分别对陕西省的陕南、陕北、关中等地区部分猪场采集的118份血清进行病毒检测。5种病毒的检出率分别是,CSFV为4.23%(5/118),PRRSV为22.01%(26/118),PCV2为15.25%(18/118),PRV为22.88%(27/118),从血清样品中未检测到PPV。本研究建立的检测RNA病毒双重RT-PCR和DNA病毒的多重PCR方法,为猪主要病毒其快速检测提供了可选择方法。     

猪瘟病毒猪细小病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒猪伪狂犬病病毒多重PCR方法的建立以及初步应用

猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪伪狂犬病病毒均能导致猪繁殖障碍,对养猪生产影响很大。本研究通过设计4对针对这4种病毒的特异引物建立了多重PCR方法,分别对其最佳反应条件、特异性及敏感性进行了测定,结果表明:其敏感性可达到CSFV 10 TCID50,PPV 10TCID50,PRRSV 1 TCID50,PRV 100 TCID50 CSFV 10TCID50,PPV 10TCID50,PRRSV 1 TCID50,PRV 100 TCID50。同时具有较好的特异性,对猪瘟病毒石门株、猪瘟病毒兔化弱毒株、PRV闽南A株、PPV弱毒疫苗株、PRRSV KY 35株及PRRSV B13株6个毒株均能扩增出相应的片段,而BVDV、BDV均未扩增出相应的片段。本方法的建立对于这4种病毒病的早期快速检测具有十分重要的意义。     

多重PCR对猪病毒性繁殖障碍疾病的调查分析

为了解猪群中病毒性繁殖障碍疾病的流行状况,用多重PCR诊断方法,对太原市附近14个养猪场和门诊病例共1068份样品进行了猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）的检测,其平均感染率分别为：PRRSV 32%、CSFV 40%、PPV 20%、PRV 12%、PCV-2 27%。其中混合感染2种病毒的猪群为39%,感染2种病毒的猪为24%。用RT-PCR试剂盒对山西省11个地市66个猪场及121个散养户的1572份血样进行了PRRSV和CSFV的检测,结果PRRSV感染率为33%,CSFV感染率为46%。用间接血凝试验对61个县38个乡136个村179户的1593份血样进行了猪瘟免疫抗体的检测,平均合格率为43.9%,从而为防控此类疫病的发生,制定综合防制措施提供试验数据。     

猪五种繁殖障碍性疫病病原体多重PCR的建立及初步应用

为了建立能够同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)的多重PCR,并用于猪场感染情况的动态监控以及临床诊断,根据GenBank中已发表的5种病毒的基因序列,针对CSFV的E2、PRRSV的Nsp2、PRV的gB、PCV2的ORF2和PPV的VP2基因,分别设计了特异性引物。在建立的单项PCR基础上,通过优化反应条件,建立了能同时检测5种病毒的多重PCR,并具有较高的灵敏性和良好的特异性。采用建立的多重PCR对127份疑似病猪的扁桃体活体组织进行检测,检出了5种病毒的存在,其中感染2种及以上病毒的样品比例为38.6%(49/127),表明该方法是一种快速、灵敏、高效的病原学检测手段。     

广西猪细小病毒与PRRSV、CSFV、PCV2、PRV混合感染的检测

应用PCR技术,对广西南宁、玉林、贵港、柳州、钦州和桂林6个市的10个规模化猪场送检的141份病猪组织样品进行猪细小病毒(PPV)的检测;同时,对鉴定为PPV阳性的样品进行了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CS-FV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪伪狂犬病毒(PRV)的检测,以确定猪群中PPV与其它病毒混和感染情况。结果,所有样品诸病毒的阳性检出率达17.73%(25/141);流产胎儿PPV阳性率为19.57%(9/46),繁殖障碍母猪扁桃体的PPV阳性率为17.74%(11/62),发病断奶仔猪组织病料的PPV阳性率为15.15%(5/33),PPV与PRRSV、CSFV、PCV2和/或PRV4种病毒均有混合感染现象,混合感染样品占PPV阳性样品的48.00%(12/25)。     

猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型的混合感染

2005年以来,贵州省一些猪场发生以母猪流产、产弱仔、死胎,仔猪腹泻、消瘦、行动障碍等为特征的疾病,剖检病猪可见心肌、肾、淋巴结等出血,肺水肿,肝脏表面有灰白色坏死点,脾脏边缘有出血性梗死,发病率和死亡率较高。运用荧光抗体技术检测猪瘟（CSF）,设计套式引物用RT PCR或PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV-2),并进行了细菌分离培养。综合临床症状、病理变化、实验室检验,确诊为猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪圆环病毒2型（PCV-2）混合感染。     

2020年秋冬季四川省内江市无害化处理病死猪5种病毒核酸检测

为了解2020年秋冬季内江市病死猪中猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒3型(PCV-3)、猪瘟病毒(CSFV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)5种病毒感染情况,在14个病死畜禽无害化处理收集点,采集108份病料样品,采用荧光PCR/RT-PCR方法进行5种病毒核酸检测。结果显示:PCV-2、PRRSV、PCV-3、CSFV的核酸检出率分别为44.4%、33.3%、12.9%、7.4%,未检出PRV核酸;双重感染检出率为18.5%,以"PCV-2+PRRSV""PCV-2+PCV-3"为主,多重感染检出率为1.9%。结果表明,内江市病死猪群中PRRSV、PCV-2感染较为严重,PCV-3零星分布,且呈现一定的混合感染状态,而CSFV和PRV感染得到有效控制。结果提示,内江市应重点加强PRRSV、PCV-2、PCV-3感染的监测与控制。     

猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、A群轮状病毒和嵴病毒多重RTPCR检测方法的建立及临床应用

本研究建立了可同时检测猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）、传染性胃肠炎病毒（TransmissiblegastroenteritisVirus,TGEV）、A群轮状病毒（GroupArotavirus,GARV）和猪嵴病毒（Porcinekobu—virus）的多重RT—PCR方法。检测中,建立的多重RT—PCR方法能够检测到500Pg的TGEV、PEDV、GARV和猪嵴病毒等量混合RNA模板,与常规的单一RT—PCR检测结果基本相同（检测TGEV、PEDV、GARV和猪嵴病毒的灵敏性分别为1000A、1000／6、93．33％和96．67％,特异性均为i00％）。结果表明,建立的多重RTPCR方法敏感性和特异性良好,可作为临床上猪病毒性腹泻病因快速、高效的诊断工具。应用该方法对2010—2012年华中地区190份腹泻仔猪样本进行检测,PEDV、TGEV、GARV和猪嵴病毒的阳性率分别为62．11％、0．53％、7．37％和82．11％。混合感染方面,PEDV和猪嵴病毒混合感染率为47．89％,PEDV和GARV混合感染率为4．74％,GARV和猪嵴病毒混合感染率为7．37％,PEDV、GARV和猪嵴病毒混合感染率为4．74％,未发现TGEV与其它3种病毒的混合感染情况。另外,有27份样本中仅检出PEDV（14．21％）,57份样本只检出猪嵴病毒（30％）。分析表明,我国自2010年底大面积暴发的病毒性腹泻是多病原混合感染造成的,主要病原为PEDV,猪嵴病毒在其中所起作用尚待进一步验证和研究。     

新疆地区4种猪病多重PCR检测方法的建立与初步应用

本试验旨在建立一种可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)、猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mh)的多重PCR检测方法。参考相关文献合成PRRSV、PCV2、PRV、Mh的特异性引物,通过对反应条件优化、特异性、敏感性测定,建立了可同时检测以上4种猪多发传染病的PCR诊断方法。扩增的片段长度分别为424 bp (PRRSV)、490 bp (PCV2)、298 bp (PRV)和360 bp (Mh),对其他常见猪病病原无特异性扩增,采用Multiplex PCR Master Mix对PRRSV、PCV2、PRV、Mh的核酸最低检出量为3个拷贝。采用多重PCR方法对60份临床样本反复检测,与单重PCR相比,4种病原符合率均为100%。结果表明,建立的多重PCR诊断方法可用于猪群中上述4种病原的单一或混合感染的快速鉴别诊断和流行病学调查。     

Establishment and Preliminary Application of the Multiplex PCR Method for Detection of 4 Kinds of Swine Diseases

The aim of this study was to establish a multiplex PCR method for simultaneously detecting porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV),porcine circovirus type 2 (PCV2),porcine pseudorabies virus (PRV) and Mycoplasma hyopneumoniae (Mh).Four pairs of primers were synthesized according to the reference.The multiplex PCR method was developed by optimizing the reaction condition,specificity and sensitivity detection.Four different amplicons with size of 424,490,298 and 360 bp for PRRSV,PCV2,PRV and Mh,respectively,were yielded.The sensitivity of multiplex PCR indicated that the detection limit was 3 copies by using Multiplex PCR Master Mix,and other common pathogens were not amplified.A total of 60 specimens from piglets were tested by multiplex PCR method.The positive accordance rate between simple and multiplex PCR was 100%.This study indicated that multiplex PCR might be a useful tool for rapid and sensitive etiological diagnosis and provided an effective technical support for pathogenic molecular epidemiology investigation.     

多重PCR方法用于检测猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒诊断方法的建立

本文建立了一种能够同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的多重PCR方法（mPCR）。借助于Oligo6.0引物设计软件,设计了4对引物分别用于扩增PCV2ORF2基因353bp片段、PPVNS-1基因271bp片段、PRRSVMN基因美洲型434bp片段、PRVgB基因194bp片段。通过人为混合以上4种病毒进行特异性及敏感性试验,结果表明,该方法具有很好的特异性和敏感性。对猪瘟病毒、大肠杆菌和双蒸水的PCR扩增结果均为阴性;该mPCR方法对PPV的最低检测量为8.64×10-3μg,PRV的最低检测量为2.36×10-3μg,PRRSV的最低检测量为3.68×10-3μg,PCV2的最低检测量为2.90×10-4μg。该方法的建立对临床上PCV2、PPV、PRV、PRRSV的鉴别诊断以及以上这4种病毒的流行病学调查具有十分重要的意义。     

猪脑心肌炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据猪脑心肌炎病毒(EMCV)3D基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因序列设计合成了两对特异性引物,经过PCR反应条件的优化,建立了EMCV和PRRSV二重RT-PCR方法,其PCR产物大小分别为286 bp和390 bp,并具有EMCV和PRRSV特征序列。该方法对EMCV和PRRSV的最低检测量分别为10×TC ID50和1×TC ID50;而对乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的PCR检测结果均为阴性;20份临床发病仔猪样品检测结果为PRRSV阳性者15份,EMCV阳性者3份,证明我国存在EMCV感染。该方法敏感、特异,可用于EMCV和PRRSV感染的检测。     

检测CSFV、JEV、PRRSV三种RNA病毒多重RT-PCR方法的建立

猪瘟病毒(CSFV)、流行性乙型脑炎病毒(JEV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是引起严重的种猪繁殖障碍的病原,而且经常混合感染,及时准确诊断是防治的前提。根据GenBank发表序列选取3对引物建立检测CSFV、JEV和PRRSV病毒的多重RT-PCR方法,扩增产物分别为508 bp、380 bp、263 bp。经与IDEXX商品化的检测CSW抗原试剂盒比较,二者的符合率为96.7%;扩增JEV和PRRSV PCR产物分别经EcoR V和Sau3A I酶切得到预期的片段。建立的多重RT-PCR检测JEV、PRRSV和CSFV敏感度分别为12.5个TCID_(50)、10个TCID_(50)和10~(-3)ng总RNA。结果表明该多重RT-PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床三种病毒核酸的检测。