PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测方法的建立及其应用

根据GenBank上已发表的猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)核苷酸序列,设计并合成能分别特异性扩增PRV、PCV-2、PPV的引物。经条件优化,建立了同时检测PRV、PCV-2、PPV的多重PCR方法,所扩增特异性产物片段大小分别为217bp、394bp、748bp。该方法不仅特异性强、敏感性高,还克服了对上述病原分别进行检测所带来的诸多弊端,为猪伪狂犬病、猪Ⅱ型圆环病、猪细小病的临床诊断和流行病学调查等研究提供了新手段。     

PRV、POV-2、PPV多重POR检测方法的建立及其应用

根据GenBank上已发表的猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪Ⅱ型圆环病毒（PCV-2）、猪细小病毒（PPV）核苷酸序列,设计并合成能分别特异性扩增PRV、PCV-2、PPV的引物。经条件优化,建立了同时检测PRV、PCV-2、PPV的多重PCR方法,所扩增特异性产物片段大小分别为217bp、394bp、748bp。该方法不仅特异性强、敏感性高,还克服了对上述病原分别进行检测所带来的诸多弊端,为猪伪狂犬病、猪Ⅱ型圆环病、猪细小病的,临床诊断和流行病学调查等研究提供了新手段。     

猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与初步应用

为了建立可同时检测猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的多重PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PRV gE基因和PCV-2 ORF2基因的核苷酸序列,分别设计了2对特异性引物PRV-S/PRV-A和PCV-2-S/PCV-2-A,产物分别为270 bp和189 bp。检测结果显示,该方法具有较高特异性,检测PRV和PCV-2的DNA最低量均为1×10~(-4)μg/μL。对136份临床上疑似为PRV和PCV-2感染病料样品进行检测的结果表明,本研究建立的多重PCR检测方法可用于临床上PRV和PCV-2引起的单纯或混合感染的传染病病原学诊断。     

检测猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的二重PCR方法的建立

作者建立了一种同时检测猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的二重PCR方法。根据GenBank上发表的PPV和PRV基因序列,针对各自保守区各设1对特异性引物,用这2对引物对同一样品中的PPV和PRV进行检测,结果同时扩增出942 bp(PPV)和485 bp(PRV)2条特异性片段。特异性试验表明,对其他几种病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,该二重PCR能检出PPV 和PRV最低浓度分别为22、11.7 pg/L。该方法的建立对临床上进行这2种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。     

猪6种常见病毒多重PCR检测方法的建立及应用

旨在建立一种可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)和猪巨细胞病毒(PCMV)的多重PCR检测方法。参考相关文献及序列比对结果设计6对特异性引物,建立了可同时检测以上6种病毒的多重PCR方法并应用此方法对临床病例进行了检测。结果表明,所建立的多重PCR方法灵敏度高,对6种病毒的最低核酸检测量分别为12.8pg(PRRSV)、46pg(CSFV)、16pg(PRV)、23.5pg(PCV-2)、72pg(PPV)、8.6pg(PCMV),对猪流感病毒(SIV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)无特异性扩增。应用该方法对临床145份样品进行检测,总阳性率为83.45%,2种以上病毒混合感染阳性率为69.66%。说明所建立的多重PCR检测方法敏感,可用于猪群中上述6种猪病病原的单一感染或混合感染的鉴别诊断。     

多重PCR检测猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒

根据猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)3种病原体的基因保守序列，分别设计了与CSFV的E2基因、PPV的VP2基因和PRV的gⅡ基因序列互补的3对引物。用这3对引物对人为混合的样品中的PPV和PRV的DNA模板及CSFV反转录后的cDNA模板进行多重PCR扩增和多重PCR反应奈件的优化，结果同时得到3务与试验设计相符的288bp(CSFV)、575bp(PPV)700bp(PRV)特异性条带；敏感性检测结果表明，该多重PCR可以检测到14．5ng／L的CSFV、27．1pg／L的PPV、31．4ng／L的PRV的核酸模板。     

猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒多重PCR检测方法的建立

本研究根据GenBank上已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)的基因序列,设计了3对特异性引物,扩增PCV2、PRV、PPV,建立了同时检测PCV2、PRV、PPV的多重PCR方法。所扩增特异性产物片段大小分别为350、191、270 bp。该方法特异性强、敏感性高,可以用于猪圆环病、猪伪狂犬病、猪细小病的实验室诊断和流行病学调查。     

应用PCR技术检测伪狂犬病病毒

根据伪狂犬病病毒(PRV)的gE基因序列,设计并合成了一对引物,以闽A株DNA为模板,建立了检测PRV的PCR方法。该方法能从猪细小病毒闽A株和FB株中扩增出一条长度为1 808 bp的片段,对Bartha株、gE-株检测为阴性;而以猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒和正常细胞的核酸为模板的均为阴性;敏感性试验表明,该体系可检测到10pg的猪细小病毒基因组DNA。表明该方法适用于检测猪伪狂犬病病毒野毒株或非gE基因缺失弱毒株。     

猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型TaqMan-MGB双重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

参照GenBank中猪伪狂犬病毒(PRV)gE基因以及猪圆环病毒2型(PCV2)中ORF2特异性序列,设计特异引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件,建立了同时检测PRV野毒株和猪圆环病毒(PCV2)的双重荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果表明,该方法检测PRV和PCV2灵敏度分别可达2.23×101、4.5×102拷贝/μL,均比常规PCR检测方法高100倍;同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、均为阴性,无交叉反应;对30份疑似病料进行检测并与普通PCR进行比较,结果显示,二者检测PRV的总符合率为96.67%,检测PCV2的总符合率为93.33%。本试验建立的TaqMan-MGB双重荧光定量PCR检测方法可同时对PRV野毒株和PCV2进行早期快速诊断,可应用于病原学监测,流行病学调查等。     

猪伪狂犬病病毒疫苗株与野毒株鉴别PCR检测方法的建立及初步应用

本试验根据疫苗株缺失gE基因、野毒株和疫苗株均有gB基因的特点,设计两对引物,建立了PCR方法,使用该方法分别对PRV、PCV2、PPV、CSFV、PRRSV进行PCR检测,结果只能从PRV Fa野毒株DNA提取物中扩增出354、237 bp的核苷酸片段,从PRV Bartha-K61疫苗株扩增出237 bp的片段,其他病毒均未扩出条带,达到了区分疫苗株与野毒株的目的。同时,应用该方法对吉林省各大猪场进行了临床病料检测,结果表明,在采集的205份病料中有32份检测为猪伪狂犬病病毒野毒感染,阳性率为15.6%。     

PCV2、PRV和PRRSV多重PCR方法的建立及其应用

根据GenBank登录的猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的参考基因序列,设计3对引物分别用于扩增PCV2的ORF2基因、PRV的gE基因、PRRSV的N基因的目的片段,通过优化反应中各个影响因素,建立了PRV、PCV2、PRRSV的多重PCR（mPCR）检测方法。敏感性和特异性的结果表明,该方法对这3种病毒的最低核酸检出量分别为32.5（PRV）、25.2（PCV2）、35.9pg（PRRSV）。该方法对猪流感病毒（SIV）、猪圆环病毒1型（PCV1）、大肠杆菌、猪瘟病毒（CSFV）、猪流行性腹泻病毒（TGE）等病毒的检测结果均为阴性。200份临床样品的多重PCR结果表明,PCV2感染率为80%（160/200）,PRV感染率为21%（42/200）,PRRSV的感染率为78%（156/200）。200份临床样品主要为PCV2和PRRSV混合感染,阳性率达56.0%（112/200）。该方法的建立对这3种病毒病的早期快速检测和指导临床实践具有十分重要的意义。     

多重PCR方法用于检测猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒诊断方法的建立

本文建立了一种能够同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的多重PCR方法（mPCR）。借助于Oligo6.0引物设计软件,设计了4对引物分别用于扩增PCV2ORF2基因353bp片段、PPVNS-1基因271bp片段、PRRSVMN基因美洲型434bp片段、PRVgB基因194bp片段。通过人为混合以上4种病毒进行特异性及敏感性试验,结果表明,该方法具有很好的特异性和敏感性。对猪瘟病毒、大肠杆菌和双蒸水的PCR扩增结果均为阴性;该mPCR方法对PPV的最低检测量为8.64×10-3μg,PRV的最低检测量为2.36×10-3μg,PRRSV的最低检测量为3.68×10-3μg,PCV2的最低检测量为2.90×10-4μg。该方法的建立对临床上PCV2、PPV、PRV、PRRSV的鉴别诊断以及以上这4种病毒的流行病学调查具有十分重要的意义。     

猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒多重PCR检测方法的建立

摘要:本研究根据GenBank上已发表的猪圆环病毒2型（PCV2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）的基因序列,设计了3对特异性引物,扩增PCV2、PRV、PPV,建立了同时检测PCV2、PRV、PPV的多重PCR方法。所扩增特异性产物片段大小分别为350、191、270 bp。该方法特异性强、敏感性高,可以用于猪圆环病、猪伪狂犬病、猪细小病的实验室诊断和流行病学调查。     

5种猪病多重PCR检测方法的建立

To establish a method for simultaneous detection of classical swine fever virus (CSFV), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), pseudorabies virus (PRV), porcine circovirus type 2 (PCV2) and porcine parvovirus (PPV), a multiplex PCR was developed with a set of specific primers designed based on the conserved sequences of CSFV, PRRSV, PRV, PCV2 and PPV. Under the optimized conditions of multiplex PCR,five special fragments of 167 (CSFV),433 (PRRSV),305 (PRV), 559 (PCV2) and 882 bp (PPV) were amplified with a detection limit of 220, 1.6, 72, 400 and 370 pg, respectively. But the multiplex PCR amplification results of swine influenza virus （SIV）, Japanese encephalitis virus （JEV）, Streptococcus suis （SS） and porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） were negative．The results showed that the multiplex PCR method was capable of CSFV, PRV, PRRSV, PCV2, PPV infection of single or mixed clinical samples for rapid diagnosis.     

猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型 (porcine circovirus type 2,PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV 的VP2、PRV的 gD、和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了3种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV 313 bp、 PRV 217 bp和PCV2 447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明两者的符合率为100％,表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这3种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用建立的多重PCR检测方法,检出PPV阳性42份,阳性率为19.91%;PRV阳性26份,阳性率为12.32%;PCV2阳性56份,阳性率为26.54%;2种以上病毒混合感染25份,混合感染阳性率为11.85%。检测结果表明,山西省猪群已感染这3种疫病。     

Multiplex PCR for rapid detection of pseudorabies virus, porcine parvovirus and porcine circoviruses

A multiplex PCR (mPCR) assay was developed and subsequently evaluated for its effectiveness as a means to simultaneously detect multiple viral infections of swine. Specific primers for each of four common DNA viruses, namely, pseudorabies virus (PRV), porcine circovirus type I (PCV1), porcine circovirus type II (PCV2), and porcine parvovirus (PPV), were used for testing procedure. The assay was shown to be highly sensitive in that as little as 10(-4) ng of each of the respective amplicons (approximately equal to 10,000 molecules) was detected when a composite of all four viruses (including both field and gene-deleted permutations of PRV) was tested as a single sample. It was also effective for detecting one or more of these same viruses in various combinations in specimens including lymph nodes, lungs, spleens, and tonsils collected from clinically ill pigs, and in specimens in spleen collected from aborted fetuses. The relative efficiency (compared to performing separate assays for each virus) and apparent sensitivity of mPCR suggest its potential application for routine molecular diagnostic purposes.     

多重PCR检测猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒的研究

根据GenBank上已发表的猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）的VP2基因序列和猪伪狂犬病病毒（Porcine pseudorabies virus，PRV）的gH基因序列，设计合成了两对特异引物，分别建立了PPV和PRV的单项PCR诊断方法，通过对扩增条件的筛选，最终成功地建立了PPV和PRV的复合PCR诊断方法，即利用一次PCR反应，可同时扩增PPV的751bp和PRV355bp的特异性片段，而扩增猪圆环病毒Ⅱ型（PCV．2）及相应的培养细胞（PK-15）核酸结果均为阴性，对PPV和PRV的最低检出量分别为100Pg和10Pg的DNA。该方法适合对PPV和PRV的联合检测和鉴别诊断。