猪五种繁殖障碍性疫病病原体多重PCR的建立及初步应用

为了建立能够同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)的多重PCR,并用于猪场感染情况的动态监控以及临床诊断,根据GenBank中已发表的5种病毒的基因序列,针对CSFV的E2、PRRSV的Nsp2、PRV的gB、PCV2的ORF2和PPV的VP2基因,分别设计了特异性引物。在建立的单项PCR基础上,通过优化反应条件,建立了能同时检测5种病毒的多重PCR,并具有较高的灵敏性和良好的特异性。采用建立的多重PCR对127份疑似病猪的扁桃体活体组织进行检测,检出了5种病毒的存在,其中感染2种及以上病毒的样品比例为38.6%(49/127),表明该方法是一种快速、灵敏、高效的病原学检测手段。     

PCV2、PRV和PRRSV多重PCR方法的建立及其应用

根据GenBank登录的猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的参考基因序列,设计3对引物分别用于扩增PCV2的ORF2基因、PRV的gE基因、PRRSV的N基因的目的片段,通过优化反应中各个影响因素,建立了PRV、PCV2、PRRSV的多重PCR（mPCR）检测方法。敏感性和特异性的结果表明,该方法对这3种病毒的最低核酸检出量分别为32.5（PRV）、25.2（PCV2）、35.9pg（PRRSV）。该方法对猪流感病毒（SIV）、猪圆环病毒1型（PCV1）、大肠杆菌、猪瘟病毒（CSFV）、猪流行性腹泻病毒（TGE）等病毒的检测结果均为阴性。200份临床样品的多重PCR结果表明,PCV2感染率为80%（160/200）,PRV感染率为21%（42/200）,PRRSV的感染率为78%（156/200）。200份临床样品主要为PCV2和PRRSV混合感染,阳性率达56.0%（112/200）。该方法的建立对这3种病毒病的早期快速检测和指导临床实践具有十分重要的意义。     

猪瘟病毒猪细小病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒猪伪狂犬病病毒多重PCR方法的建立以及初步应用

猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪伪狂犬病病毒均能导致猪繁殖障碍,对养猪生产影响很大。本研究通过设计4对针对这4种病毒的特异引物建立了多重PCR方法,分别对其最佳反应条件、特异性及敏感性进行了测定,结果表明:其敏感性可达到CSFV 10 TCID50,PPV 10TCID50,PRRSV 1 TCID50,PRV 100 TCID50 CSFV 10TCID50,PPV 10TCID50,PRRSV 1 TCID50,PRV 100 TCID50。同时具有较好的特异性,对猪瘟病毒石门株、猪瘟病毒兔化弱毒株、PRV闽南A株、PPV弱毒疫苗株、PRRSV KY 35株及PRRSV B13株6个毒株均能扩增出相应的片段,而BVDV、BDV均未扩增出相应的片段。本方法的建立对于这4种病毒病的早期快速检测具有十分重要的意义。     

种公猪精液中与繁殖障碍有关的6种病毒的检测

采用PCR和RT-PCR技术,于2006年4月～10月对上海及其周边地区的30个猪场和人工授精站的生产公猪精液样品355份进行了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV)、猪瘟病毒(CSFV)和日本脑炎病毒(JEV)等6种与猪繁殖障碍有关的病毒的检测,结果表明,日本脑炎病毒检测为阴性,检出PRRSV、PRV、CSFV、PPV和PCV阳性数和阳性率分别为6份(1.69%)、9份(2.54%)、5份(1.41%)、75份(21.1%)、6份(1.69%),有一个猪场的5份样品存在PRV和PPV混合感染.     

猪全血中多种病原流行病学监测的初步研究

本文利用PCR或RT-PCR技术连续两年对规模猪场采集的猪全血分别进行猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖障碍综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和日本乙型脑炎病毒（JEV）的检测,结果发现2008年猪全血中CSFV、PRRSV、PRV、PCV2的感染率为30.0%、50.0%、4.0%和30.0%,2009年猪全血中CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、BVDV和JEV的感染率分别为19.8%、13.7%、1.1%、31.9%、0.7%和2.7%,这表明用猪的全血可进行猪瘟等6种疫病的监测和流行,为更深入研究疫病的流行病学奠定了基础。     

2010年国内部分省份猪场常见病毒性疾病的病原学调查

随着规模化养猪业的发展,传染性疾病越来越多,混合感染或多重感染十分普遍,给疾病的诊断和预防带来很大困难。本文将我们实验室2010年分别采自福建、广西、河南、上海、内蒙、浙江、江苏和山西等地发病猪场的185份病料,通过RT-PCR和PCR方法对其进行猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）、猪繁殖障碍的猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）、猪圆环病毒2（Porcine circovirus type 2,PCV2）、猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）、猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）、细环病毒2（Torque teno virus 2,TTV2）等病毒检测。结果表明在所检的病料中PRRSV、PCV2和TTV2的阳性率比较高,分别为49.2%、62.2%和95.1%。有些地方TTV2的阳性率高达100%;同时,还存在很普遍的PRRSV与PCV2、PRRSV与TTV2、PCV2与TTV2等混合感染,混合感染率分别为27.6%、45.4%、58.4%;以及PRRSV、PCV2与TTV2的三重感染率为24.9%。同时对部分PRRSV阳性病料的PRRSV GP5和nsp2基因分别进行测序,分析测序结果表明病料中的PRRSV的GP5和nsp2序列与PRRSV HuN4株的相应序列的亲缘关系分别在98.2%和96.2%以上,且在nsp2区域都存在30个不连续氨基酸的缺失,说明现在临床中所流行的PRRSV可能仍是与高致病性PRRSV基因型相似的病毒。通过本文可以及时了解当前养猪场的病毒性疾病的流行情况,为猪场病毒性疾病的防控提供依据。     

2018年广西重要猪源病毒性疫病流行病学调查

为了解2018年广西猪群重要疫病流行情况,试验采集广西各地的病死猪组织样品及病猪腹泻拭子,应用多重实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）,应用多重实时荧光定量PCR检测猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）及猪圆环病毒3型（PCV3）,应用多重RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪轮状病毒（PRoV）。结果显示,所检测的694份组织样品中,CSFV、PRRSV、HP-PRRSV、PRV、PCV1、PCV2、PCV3的阳性率分别为11.10%、18.88%、7.20%、5.19%、2.45%、67.00%和5.76%;2种病原混合感染率为41.21%,3种病原混合感染率为4.32%,其中PRRSV和PCV2混合感染率最高。所检测的792份肠内容物及拭子腹泻样品中,PEDV、PDCoV、TGEV、PRoV的阳性率分别为9.72%、5.81%、1.77%和6.31%;2种病原混合感染率为5.30%,其中PEDV和PRoV混合感染率最高。结果表明,当前多种重要病毒性疫病仍在广西猪群发生和流行,并且多重感染普遍存在,应进一步加强监测和防控。     

兽用疫苗中BVDV、PCV2和PPV污染三重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立可以快速同时检测兽用疫苗中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)3种病原的方法,通过研究比对BVDV 5'-UTR、PCV2 Rep以及PPV NS1基因序列,分别设计合成了3对引物和3条荧光探针,在优化反应条件和反应程序后,建立了一种可同时检测BVDV、PCV2以及PPV的三重荧光定量PCR方法,并对其敏感性、特异性进行了评估。结果显示,建立的三重荧光定量PCR方法灵敏度高,对3种病原核酸的最低检测限均为10 copies/μL;特异性强,与其他相关病原(猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、非洲猪瘟病毒)均无交叉反应。结果表明,本试验建立的三重荧光定量PCR适于疫苗中外源病毒的检测,可用于疫苗等生物制品质量把控。     

猪瘟病毒和不同型猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立

为建立能同时检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,针对CSFV和PRRSV的基因序列设计3对特异性引物,第1对引物扩增CSFV毒株NS2基因508bp片段,第2对引物扩增PRRSV美洲型经典毒株和变异毒株Nsp2基因338bp/248bp片段,第3对引物扩增PRRSV欧洲型毒株ORF5基因614bp片段。经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分CSFV毒株和PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株及欧洲型毒株的多重RT-PCR方法。该方法可以特异扩增CSFV和PRRSV,而与猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均无交叉反应;对CSFV和PRRSV 4种重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝/μL。对采集的106份临床疑似病料进行检测,结果CSFV和PRRSV变异株混合阳性4份,占3.77%(4/106);CSFV阳性7份,占6.60%(7/106);PRRSV变异株阳性17份,占16.04%(17/106)。结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法可以用于CSFV和PRRSV的临床快速鉴别诊断和流行病学调查。