青海省部分地区PEDV、TGEV和RV感染情况调查与分析

为了解青海省部分地区猪群中猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(RV)导致猪病毒性腹泻疫病的感染情况与发生现状,本研究首次应用RT-PCR方法对2012年采集的青海省部分地区60份伴有腹泻症状的疑似猪病毒性腹泻病毒感染的临床病料进行猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒和猪传染性胃肠炎病毒的检测与分析.结果显示PEDV、RV和TGEV的阳性率分别为76.7％、51.7％和30.0％;总单独感染率为35.0％,各自单独感染率分别为25.0％、8.33％和1.67％;总混合感染率为51.67％,PEDV/RV、PEDV/ TGEV、PEDV/RV/TGEV的混合感染率分别为23.33％、8.33％和51.67％,不存在RV/TGEV混合感染型.结果表明,青海省部分地区存在这3种导致猪病毒性腹泻疫病病毒的流行,包括单独感染流行和混合感染流行;单独感染中以PEDV流行为主,混合感染中以PEDV/RV和PEDV/RV/TGEV混合感染流行为主;总混合感染率比总单独感染率高.目前青海省部分地区发生的猪病毒性腹泻以PEDV为主要病因,且PEDV/RV、PEDV/RV/TGEV混合感染现象严重,为该地区猪病毒性腹泻的诊断和防控积累了资料.     

山东省猪腹泻病例中PEDV、TGEV和PRV的感染调查与分析

为了解山东省规模化猪场由猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪伪狂犬病毒（PRV）引起猪病毒性腹泻的流行情况,自2014年1月至2016年12月,对来自山东省各地规模化猪场的猪腹泻病料（共3 035份）进行PCR检测。结果显示,PEDV、PRV和TGEV阳性率分别为67.49%、9.33%和3.29%;3年间,PEDV阳性率在2014年第四季度最低,为48.15%,2015年第四季度阳性率最高,为88.57%,2016年各季度阳性率相对2015年呈波动下降趋势;TGEV阳性率在2014年第四季度最高,为18.52%,2015年第三季度阳性率为15.38%,2016年第一季度阳性率为6.67%,其他季度未检测出阳性病料;PRV阳性率在2016年第二季度最高,为15.68%,除2014年第一季度未检出阳性病料外,2014年第二季度阳性率最低,为2.56%。通过对69份被动送检的病料进行PEDV、TGEV和PRV混合感染检测发现,这部分病料中PEDV、TGEV、PRV阳性率分别为86.96%、5.80%和37.68%;总单独感染率为69.57%,PEDV、TGEV和PRV单独感染率分别为57.97%、1.45%和10.14%;总混合感染率为30.43%,PEDV/PRV、PEDV/TGEV和TGEV/PRV混合感染率分别为26.09%、2.90%和1.45%;总单独感染率比总混合感染率高。结果表明,山东省存在PEDV、PRV和TGEV 3种病毒流行,存在PEDV/TGEV、TGEV/PRV和PEDV/PRV的混合感染,混合感染中主要为PEDV/PRV混合感染,不存在PEDV/PRV/TGEV的混合感染。目前PEDV是引起山东省猪病毒性腹泻的主要病因,本试验结果可为山东省猪病毒性腹泻的诊断和控制提供参考。     

四川部分猪场PEDV、TGEV、GARV和PKV感染状况调查

为了解四川省部分猪场4种猪腹泻病毒的感染情况,为本地区猪腹泻的诊断和治疗提供依据,采用RT-PCR方法,分别对来自四川省成都、绵阳、德阳、眉山、资阳、雅安、内江、宜宾、达州等地9个规模化猪场的90份临床健康猪和130份腹泻猪的粪便样品,进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪嵴病毒(PKV)和猪A群轮状病毒(GARV)的检测。结果表明,在所有9个猪群中PEDV和PKV检出率达100%(9/9),且在部分猪群腹泻样本中的检出率可达到60%以上,表明此2种病原在检测猪场感染比较普遍。此外腹泻样本中TGEV和GARV阳性率分别为11.54%(15/130)、7.69%(10/130),表明该2种病原在本地区猪场仍有感染情况存在。对PKV的检测结果表明腹泻猪粪便中PKV的阳性率为43.85%(57/130),显著高于外表健康猪粪便样本23.33%(21/90),且PEDV和PKV的混合感染在4种病原混合感染类型中所占比例最大,推断PKV与猪只腹泻具相关性,PEDV和PKV具有协同致病的可能。     

四川某猪场仔猪腹泻病的病原学诊断

四川省双流区某商品猪场的5~10日龄仔猪暴发腹泻,且传播迅速,为查明病因,我们采集腹泻仔猪肛拭子15份,用RT-PCR分别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪A群轮状病毒(GARV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪Delta冠状病毒(PDCoV)。结果显示:样本的总阳性率为14/15,其中PEDV、GARV的阳性数分别为11、8,双阳性数为5,而TGEV和PDCoV未检出,说明该猪场仔猪腹泻由PEDV及GARV感染引起,且PEDV和GARV混合感染的情况较为严重。     

2012—2013年福建省猪流行性腹泻流行病学调查

为探求2012—2013年福建省猪流行性腹泻病毒引起猪腹泻所占比例及流行情况,采用PCR方法对采自福建省62个规模猪场的128份发生腹泻病料进行猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、轮状病毒（PROV）、猪瘟病毒（csFv）、蓝耳病病毒（PRRSV）和伪狂犬病病毒（PRV）等病原调查,结果显示：检测出PEDV的阳性率为67．97％（871128）,其中PEDV与TGEV混合感染为19．53％（25／128）,PEDV与PROV混合感染为3．9l％（51128）,PEDV与PRV混合感染为14．84％（191128）,PEDV与PRRSV混合感染为6．25％（81128）,未检测出与csF、r混合感染。通过对流行PEDV的ORF3和M基因序列分析表明：流行PEDV毒株的2个基因片段均有出现新变异,其中1株与近年来韩国、泰国等流行毒株亲缘关系较远。     

贵州省仔猪病毒性腹泻病原学调查

为了解贵州省仔猪病毒性腹泻病原流行情况,对2013—2015年贵州省7个市(州)采集的35个规模养猪场316份仔猪腹泻粪便样品进行病原核酸检测。结果显示,各地均存在猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)感染,PEDV阳性率为62.43%,TGEV阳性率为7.91%,PoRV阳性率为11.76%。不同病原在不同地区呈显著流行趋势,且存在不同程度的混合感染,PEDV与PoRV混合感染率为18.04%,PEDV与TGEV混合感染率为5.06%,TGEV与PoRV混合感染率为3.80%,PEDV、TGEV与PoRV混合感染率为1.90%,近3年主要流行病原为PEDV。为临床防控仔猪病毒性腹泻发生提供了理论依据。     

2018年广西重要猪源病毒性疫病流行病学调查

为了解2018年广西猪群重要疫病流行情况,试验采集广西各地的病死猪组织样品及病猪腹泻拭子,应用多重实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）,应用多重实时荧光定量PCR检测猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）及猪圆环病毒3型（PCV3）,应用多重RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪轮状病毒（PRoV）。结果显示,所检测的694份组织样品中,CSFV、PRRSV、HP-PRRSV、PRV、PCV1、PCV2、PCV3的阳性率分别为11.10%、18.88%、7.20%、5.19%、2.45%、67.00%和5.76%;2种病原混合感染率为41.21%,3种病原混合感染率为4.32%,其中PRRSV和PCV2混合感染率最高。所检测的792份肠内容物及拭子腹泻样品中,PEDV、PDCoV、TGEV、PRoV的阳性率分别为9.72%、5.81%、1.77%和6.31%;2种病原混合感染率为5.30%,其中PEDV和PRoV混合感染率最高。结果表明,当前多种重要病毒性疫病仍在广西猪群发生和流行,并且多重感染普遍存在,应进一步加强监测和防控。     

凉山地区猪腹泻样本中PEDV、PDCoV和GARV感染检测

为了解四川省凉山州部分猪场3种猪腹泻病毒的感染情况,本研究采用RT-PCR方法,分别对来自德昌、冕宁县和宁南县多个规模化猪场的60份猪腹泻样本进行病原检测,包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)和猪A群轮状病毒(GARV)。结果显示:3种病原的检出率分别为PEDV15%、PDCoV33.33%、GARV58.33%,其中冕宁县PDCoV检出率为65%,而GARV检出率更高达70%;3种病毒混合感染的情况普遍存在,总体混合感染率分别为:德昌15%(3/20),冕宁60%(12/20),宁南5%(1/20),混合感染类型中尤以PDCoV和GARV的混合感染率最高,提示PDCoV和GARV可能存在更高的协同致病性。     

龙岩地区仔猪病毒性腹泻发病率调查

为了解闽西地区仔猪病毒性腹泻的流行情况,对2013年9月份—2016年3月份在龙岩市收集的99份疑似病毒性腹泻样品进行猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和轮状病毒(RV)的RT-PCR检测。结果表明:TGEV、PEDV及RV阳性检出率分别为21.21%、38.38%和32.32%;TGEV和PEDV的混合感染阳性检出率为2.02%,TGEV和RV的混合感染阳性检出率为5.05%;PEDV和RV的混合感染阳性检出率为8.08%;TGEV、PEDV和RV三者混合感染的阳性检出率为1.01%。说明龙岩地区仔猪病毒性腹泻感染情况较严重。     

贵州省部分地区规模化猪场仔猪4种致猪腹泻病病毒感染调查

为了解贵州省规模化猪场猪病毒性腹泻的流行情况,从5个地区9个规模化猪场采集的腹泻仔猪的粪便和病死猪的肠内容物及肠系膜淋巴结共66份,采用PCR或RT-PCR方法,分别进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的核酸检测。结果显示,PEDV、TGEV、RV和PCV-2检出率分别为72.72%、1.52%、12.12%和3.03%;PEDV/PCV-2、PEDV/RV、PEDV/TGEV混合感染率分别为3.03%、15.2%和1.52%,总混合感染率为19.70%,其中5个猪场为PEDV单独感染。结果表明,贵州省部分地区规模化猪场发生腹泻病的主要病原为PEDV,其次是TGEV、RV和PCR-2,且存在混合感染,为贵州省猪病毒性腹泻的防控提供一定的参考资料。     

PEDV、TGEV、PoRV和PKV多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为快速鉴别诊断猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪嵴病毒(PKV),根据PEDV的M基因、TGEV的N基因、PoRV的VP6基因和PKV的3D基因序列设计4对特异性引物,通过PCR扩增目的片段并构建重组质粒,建立了一种可同时检测4种病毒的RT-PCR诊断方法,该方法可特异性扩增这4种病毒的相应片段,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)均无扩增,最低检出量分别为1.33×10^4、1.33×10^3、1.33×10^4、1.33×10^5copies/μL。应用该方法对临床55份猪腹泻样品进行检测,结果检测出14份PEDV、1份PoRV和27份PKV,未检出TGEV,其中PEDV和PKV混合感染9份。上述结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法快速、特异、敏感,可用于以上4种腹泻病毒的临床检测和流行病学调查。     

猪流行性腹泻新毒株的分离鉴定和致病性研究

为探明2011年我国猪群仔猪腹泻的病因,采用巢式RT-PCR方法对河南和辽宁省2个规模猪场采集43份出现腹泻的粪便进行猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和轮状病毒（PRoV）的检测,结果表明：43份腹泻样品均为PEDV,没有检测出TGEV和PRoV。对扩增的PEDV进行测序和分析显示,这些PEDV流行毒株均属于基因G2.3亚型,彼此之间的同源性高达99.2%～100%,与2011年韩国和2008年泰国流行的PEDV毒株同属于一个进化分支。将其中3份病料在Vero细胞传代后接种2日龄仔猪,结果发现接种后13～57h内仔猪全部死亡,接种仔猪呈现典型的腹泻症状和病理变化特征,提示了这些PEDV流行毒株具有较强的致病性。     

PEDV、TGEV和PRoV多重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）及猪轮状病毒（PRoV）的快速鉴别检测方法,本试验针对PEDV、TGEV、PRoV的基因组序列设计3对特异性引物PEDV-N、TGEV-M和PRoV-VP6,分别扩增PEDV N基因、TGEV M基因和PRoV VP6基因。经优化反应条件,成功建立了能同时检测并区分PEDV、TGEV、PRoV的多重RT-PCR方法。该方法可特异扩增PEDV、TGEV、PRoV相应的基因片段,而与猪瘟病毒（CSFV）、猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒2型（PCV2）均无交叉反应;对PEDV、TGEV、PRoV基因重组质粒标准品的检出限分别为1.41×10³、1.41×10²和1.41×10³拷贝/μL;在相同条件下重复试验可获得一致的结果。应用该方法对临床采集的190份腹泻病料进行检测,结果PEDV阳性42份,阳性率22.11%;TGEV阳性58份,阳性率30.53%;PRoV阳性34份,阳性率17.89%,且存在不同病毒混合感染的现象。结果表明,所建立的多重RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的优点,可用于PEDV、TGEV和PRoV的临床检测和流行病学调查。     

Establishment and Application of a Multiplex RT-PCR Assay for Detection of PEDV,TGEV and PRoV

In this study,a multiplex RT-PCR assay was established to differentially detect porcine epidemic diarrhea virus (PEDV),porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and porcine rotavirus (PRoV) after optimization of the reaction conditions.Three pairs of primers PEDV-N,TGEV-M and PRoV-VP6 were designed for specifically amplifying PEDV N gene,TGEV M gene and PRoV VP6 gene,respectively.The assay could specifically amplify PEDV,TGEV and PRoV,but not classical swine fever virus (CSFV),porcine foot and mouth disease virus (FMDV),pseudorabies virus (PRV),porcine parvovirus (PPV) and porcine circovirus type 2 (PCV2).The detection limits of PEDV,TGEV and PRoV standard recombinant plasmids were 1.41×10³,1.41×10² and 1.41×10³ copies/μL,respectively.The repeated reaction under the same conditions obtained uniform results.The assay was used to detect a total number of 190 clinical samples,of which 42 (22.11%) samples were positive for PEDV,58 (30.53%) samples for TGEV and 34 (17.89%) samples for PRoV,and there were mixed infection among these viruses.The results indicated that this multiplex RT-PCR assay had the advantages of sensitivity,specificity and repeatability and provided a useful tool for differential detection and epidemiological investigation of PEDV,TGEV and PRoV.     

猪6种常见病毒多重PCR检测方法的建立及应用

旨在建立一种可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)和猪巨细胞病毒(PCMV)的多重PCR检测方法。参考相关文献及序列比对结果设计6对特异性引物,建立了可同时检测以上6种病毒的多重PCR方法并应用此方法对临床病例进行了检测。结果表明,所建立的多重PCR方法灵敏度高,对6种病毒的最低核酸检测量分别为12.8pg(PRRSV)、46pg(CSFV)、16pg(PRV)、23.5pg(PCV-2)、72pg(PPV)、8.6pg(PCMV),对猪流感病毒(SIV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)无特异性扩增。应用该方法对临床145份样品进行检测,总阳性率为83.45%,2种以上病毒混合感染阳性率为69.66%。说明所建立的多重PCR检测方法敏感,可用于猪群中上述6种猪病病原的单一感染或混合感染的鉴别诊断。     

An ELISA optimized for porcine epidemic diarrhoea virus detection in faeces

Monoclonal antibodies to porcine epidemic diarrhoea virus (PEDV) membrane protein M were prepared and used for the comparative assessment of three blocking ELISA variants to detect PEDV. The competitive blocking ELISA (CB-ELISA) format showed the highest sensitivity, allowing detection of 10(2.5) plaque-forming units of PEDV/ml in culture medium. Its specificity was verified by inclusion of control samples containing transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and rotavirus A in each analysis. Eighty porcine field samples of faeces obtained from 38 herds affected with diarrhoea were examined, and PEDV was found in 15 (19%) samples from 6 (16%) herds. The suitability of the CB-ELISA for the screening herds in epizootiologic situations is discussed.     

猪传染性胃肠炎与流行性腹泻病毒二重RT-PCR 检测方法的建立及应用

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)与流行性腹泻病毒(PEDV)的快速鉴别诊断方法,本研究根据GenBank已登录的TGEV核蛋白(N)基因和PEDV膜蛋白(M)基因保守区域序列分别设计了1对特异性引物,以TGEV和PEDV混合总RNA为反转录模板,建立了TGEV和PEDV的二重RT-PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了应用检测,并对检测到的阳性样品进行克隆测序。结果表明,成功建立了TGEV和PEDV二重RT-PCR检测方法,该方法的检测灵敏度最低极限为10 TCID₅₀/mL病毒含量,重复性好,特异性强,可特异性地扩增TGEV和PEDV细胞培养物,但对ST细胞和其他7种病原对照扩增不出任何条带;对22份临床疑似TGEV和PEDV感染样品检测结果与测序结果完全一致。本研究成功建立了TGEV与PEDV二重RT-PCR检测方法,可适用于猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病的快速鉴别诊断。