同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的四重实时荧光RT-PCR方法的建立及应用

为实现对猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)、猪传染性胃肠炎(porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、猪轮状病毒(porcine rotavirus, PoRV)和猪流性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的同时鉴别检测,根据PDCoV M基因、TGEV S基因、PoRV VP6基因和TGEV N基因保守区域序列合成特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,成功建立了一种可同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的实时荧光RT-PCR方法。结果显示,所建立的四重实时荧光RT-PCR方法仅对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV出现阳性扩增,与PRV、PPV、PRRSV、CSFV、PCV2等猪常见病原无交叉反应;对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的最低检出限分别为1.17×10³,1.13×10³,1.31×10²和1.18×10^2<...     

PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)的方法,本研究分别针对PEDVN基因、TGEVM基因、PDCoVM基因和PRoVVP6基因设计特异性引物和TaqMan探针,经过优化反应条件,建立了同时检测4种病毒的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法仅特异性扩增PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,与猪其它主要病毒无交叉反应,特异性较强;对PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的质粒标准品的最低检出限分别为2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^1拷贝/μL、2.06×10^3拷贝/μL,具有较高敏感性;组内与组间变异系数均小于1.1%,具有良好的重复性。应用该方法和普通多重RT-PCR检测临床采集的243份腹泻病料样品,两者的符合率为96.71%。本研究建立的方法为临床PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的鉴别检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感、高效的技术手段。     

PEDV、TGEV和PoRV三重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速、敏感的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)三重PCR检测方法,根据GenBank登录的PEDV S基因、TGEV M基因和PoRV VP7基因参考序列,设计3对特异性引物,以克隆的质粒为模板,进行反应条件的优化以及特异性、敏感性试验。结果采用所建立的方法能够扩增出PEDV、TGEV和PoRV特异性片段,且不能检出PCV2、CSFV、PRRSV;对PEDV、TGEV和PoRV质粒模板的最低检测量分别为1×10~2拷贝/μL、1×100拷贝μL、1×10~3拷贝/μL;对10~2份临床病料进行检测,结果 PEDV、TGEV和PoRV的检出率分别为37.25%、1.96%和6.86%,与单项PCR检测结果进行比较,符合率均为100%。结果表明,所建立的三重PCR检测方法可为猪病毒性腹泻病的快速诊断及流行病学调查提供技术支持。     

4种猪腹泻病毒恒温隔绝式荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

为鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)这4种猪主要腹泻病毒，本研究分别针对PEDV M基因、TGEV M基因、PoRV NSP5基因、PDCoV M基因设计特异性引物和探针，经过方阵法优化恒温隔绝式荧光RT-PCR(iiRT-PCR)反应条件，建立了检测这4种猪腹泻病毒iiRT-PCR方法。用建立的iiRT-PCR方法分别检测PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本脑炎病毒(JEV),并对iiRT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示该方法特异性强，对PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的检测下限分别为10²、10²、10³、10³ TCID₅₀/mL,并具有良好的组内和组间重复性；而荧光定量PCR方法的检测下限分别为10¹、10²、10²、10^2<...     

猪腹泻相关病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PRV VP6基因序列设计合成引物,利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PRV进行多重RT-PCR扩增,结果显示,该方法可以同时扩增PEDV(682 bp)、TGEV(480 bp)和PRV(297 bp)的特异性DNA片段,而对猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该多重RT-PCR方法对PEDV、TGEV和PRV的最低检出量分别为3.3×103拷贝/μL、3.2×103拷贝/μL和2.8×103拷贝/μL。利用建立的多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR对20份临床病料进行检测,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可以用于这3种病毒的同时检测和疾病的鉴别诊断。     

猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A型轮状病毒多重RT-PCR方法的建立及其应用

为了建立一种能够同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(RVA)的敏感、特异的多重RT-PCR(mRT-PCR)方法,本试验分别针对PEDV和TGEV的N基因、RVA的VP7基因设计了4对引物(其中针对PEDV N基因的引物为内、外2对),结合mRT-PCR和PEDV的套式RT-PCR(nRTPCR),建立了检测PEDV、TGEV和RVA的mRT-PCR方法。mRT-PCR能够同时扩增出针对3种病毒的预期大小的目的核苷酸片段,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒及猪圆环病毒2型等病毒无交叉反应;可以检测到PEDV、TGEV和RVA的最低核酸浓度分别为16.07、803.9和321.5μg/L。应用mRT-PCR检测了31份腹泻仔猪的血清、肛拭子或小肠组织,其中PEDV、TGEV与RVA的阳性率分别为61.29%、6.45%和25.81%,并检测到了PEDV与RVA或TGEV双重感染及PEDV、TGEV和RVA三重感染的样品。在检测临床样品时,mRT-PCR和单项RT-PCR检出PEDV、TGEV和RVA的符合率分别为96.77%、93.54%和93.54%。上述结果表明,mRTPCR能够快速鉴别检测PEDV、TGEV和RVA 3种病毒,PEDV是引起当前仔猪腹泻的主要病原。     

猪Delta冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR检测方法的建立及应用

猪Delta冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均是能引起仔猪腹泻的冠状病毒,通过临床症状和剖检很难鉴别诊断,建立同时检测且能够鉴别诊断这3种疾病的快速检测方法对于临床诊断具有重要的意义。参照GenBank中登录的PDCoV,NPEDV M和TGEV N基因的基因序列,利用Primer5.0设计合成3对能扩增特异性目的片段的引物,构建重组质粒,并对RT-PCR反应条件进行优化,建立了检测PDCoV,PEDV和TGEV的多重RT-PCR诊断方法,并对所建立的方法进行敏感性、特异性和重复性分析。利用该方法对河南176份临床样品进行检测,并与普通RT-PCR检测方法对该检测方法进行比较分析。结果表明,所建立的三重RT-PCR方法对PDCoV的最低检测量是3.14×103拷贝/μL;PEDV的最低检测量是3.88×104拷贝/μL和TGEV的最低检测量是3.68×104拷贝/μL。所建立的方法具有较好的特异性,对猪博卡病毒(PboV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟(CSFV)和猪圆环病毒(PCV)等猪常见病毒的扩增结果均为阴性。应用所建立的三重RT-PCR方法对176份临床收集的仔猪腹泻样品进行PEDV,PDCoV和TGEV检测,并将检测结果和单重RT-PCR检测方法比较,结果显示,多重RT-PCR检测结果与常规单一RT-PCR的结果符合率均为100%。综上,本试验建立了能同时检测PDCoV,PEDV和TGEV的三重RT-PCR方法,为临床上这3种疫病的快速检测和流行病学调查奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒野毒株及弱毒疫苗株RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)野毒株及弱毒疫苗株快速鉴别检测方法,根据Gen Bank中公布的PEDV野毒株及弱毒疫苗株的ORF3基因序列,在缺失区的两端设计合成1对特异性扩增引物,用以特异性的扩增PEDV ORF3基因片段,根据目的片段大小判断PEDV的毒株类型;通过退火温度等反应条件优化,建立了区分PEDV野毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR鉴别检测方法。结果显示:所建立的RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分PEDV野毒株和弱毒疫苗株;PEDV野毒株扩增出234 bp目的片段,PEDV弱毒疫苗株扩增出185 bp目的片段;与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、A群猪轮状病毒(PRo VA)、猪嵴病毒(PKV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪乙型脑炎病毒(JEV)及猪细小病毒(PPV)均无交叉反应;敏感性试验显示,该方法能检测到病毒滴度为1.3×10~3TCID_(50)/mL。利用该方法对采集自广西部分地区93份临床腹泻样品进行检测,临床腹泻样品中PEDV野毒株阳性率为61.29%(57/93),弱毒株阳性率为5.38%(5/93)。结果表明:该RT-PCR鉴别检测方法特异性强、灵敏度高、操作简便,能快速、准确地区分PEDV自然感染野毒株和弱毒疫苗毒株,为猪流行性腹泻的快速诊断及病原分子鉴别检测研究提供了可供借鉴的技术手段。     

PEDV、TGEV和PRoV多重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）及猪轮状病毒（PRoV）的快速鉴别检测方法,本试验针对PEDV、TGEV、PRoV的基因组序列设计3对特异性引物PEDV-N、TGEV-M和PRoV-VP6,分别扩增PEDV N基因、TGEV M基因和PRoV VP6基因。经优化反应条件,成功建立了能同时检测并区分PEDV、TGEV、PRoV的多重RT-PCR方法。该方法可特异扩增PEDV、TGEV、PRoV相应的基因片段,而与猪瘟病毒（CSFV）、猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒2型（PCV2）均无交叉反应;对PEDV、TGEV、PRoV基因重组质粒标准品的检出限分别为1.41×10³、1.41×10²和1.41×10³拷贝/μL;在相同条件下重复试验可获得一致的结果。应用该方法对临床采集的190份腹泻病料进行检测,结果PEDV阳性42份,阳性率22.11%;TGEV阳性58份,阳性率30.53%;PRoV阳性34份,阳性率17.89%,且存在不同病毒混合感染的现象。结果表明,所建立的多重RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的优点,可用于PEDV、TGEV和PRoV的临床检测和流行病学调查。     

Establishment and Application of a Multiplex RT-PCR Assay for Detection of PEDV,TGEV and PRoV

In this study,a multiplex RT-PCR assay was established to differentially detect porcine epidemic diarrhea virus (PEDV),porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and porcine rotavirus (PRoV) after optimization of the reaction conditions.Three pairs of primers PEDV-N,TGEV-M and PRoV-VP6 were designed for specifically amplifying PEDV N gene,TGEV M gene and PRoV VP6 gene,respectively.The assay could specifically amplify PEDV,TGEV and PRoV,but not classical swine fever virus (CSFV),porcine foot and mouth disease virus (FMDV),pseudorabies virus (PRV),porcine parvovirus (PPV) and porcine circovirus type 2 (PCV2).The detection limits of PEDV,TGEV and PRoV standard recombinant plasmids were 1.41×10³,1.41×10² and 1.41×10³ copies/μL,respectively.The repeated reaction under the same conditions obtained uniform results.The assay was used to detect a total number of 190 clinical samples,of which 42 (22.11%) samples were positive for PEDV,58 (30.53%) samples for TGEV and 34 (17.89%) samples for PRoV,and there were mixed infection among these viruses.The results indicated that this multiplex RT-PCR assay had the advantages of sensitivity,specificity and repeatability and provided a useful tool for differential detection and epidemiological investigation of PEDV,TGEV and PRoV.     

Investigation on Pathogens of Major Viral Diarrhea in Pig Farms in East China from 2017 to 2019

To investigate the epidemic situation of viral diarrhea in East China in recent years, and provide epidemiological survey data for comprehensive prevention, 549 fecal samples were collected in 2017-2019 from diarrhea pigs in 5 cities of East China and RT-PCR were used to detect porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), porcine rotavirus (PoRV), porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV), porcine deltacoronavirus (PDCoV) and porcine Sapelovirus (PSV), and statistical analysis of its positive rate and mixed infection was performed.The results showed that during 2017 and 2019, PEDV,PDCoV,PoRV,TGEV and PSV positive rate were 62.6% (372/594),27.9% (166/594),16.8% (100/594),13.3% (79/594), and 3.87% (23/594), respectively.In the double mixed infection, the average mixed infection rate of PEDV + PDCoV and PEDV + PoRV were the main ones, which were 22.4% (133/594) and 13.3% (79/594), respectively. Among the triple infections, the mixed infection rate of PEDV + PoRV + PDCoV was dominated by 7.58% (45/594), and there were no mixed infections of four and five pathogens. The highest positive detection rate of PEDV was during 2017 and 2019, and mixed infection with PoRV and PDCoV, which was currently the focus of prevention and control of viral diarrhea in East China. TGEV and PDCoV accounted for a large proportion of the detection rate of healthy fattening pigs and sows, indicating that recessive infections had become common and deserve attention from farmers. In addition, the detection rate of PSV was more lower than the other four diarrhea viruses. On the whole, since August 2018 that the farms strengthened biosecurity prevention and control measures, the detection rate of various pathogens and the detection rate of sites have shown a downward trend year by year.     

2017—2019年华东地区猪场主要病毒性腹泻病原调查

本研究旨在了解当前我国华东地区引起猪腹泻的主要病毒性腹泻病原的流行情况，为该地区更好地开展猪腹泻病毒的防控工作提供临床数据。分别采用RT-PCR检测方法对2017—2019年华东地区35个场别594份临床样品检测猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、猪轮状病毒（porcine rotavirus，PoRV）、猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）、猪丁型冠状病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV）和猪萨佩罗病毒（porcine Sapelovirus，PSV）等5种猪的病毒性腹泻病原，并对其阳性率及混合感染情况进行统计分析。结果显示，2017—2019年的PEDV、PDCoV、PoRV、TGEV及PSV的平均阳性率为分别为62.6%（372/594）、27.9%（166/594）、16.8%（100/594）、13.3%（79/594）及3.87%（23/594），二重混合感染中以PEDV+PDCoV及PEDV+PoRV为主，平均混合感染率分别为22.4%（133/594）和13.3%（79/594）。三重感染中以PEDV+PoRV+PDCoV混合感染为主，感染率为7.58%（45/594），未见四重及五重病原混合感染。2017—2019年PEDV平均阳性检出率最高，且常与PoRV及PDCoV发生混合感染，是当前华东地区猪病毒性腹泻类疫病的防控重点。TGEV和PDCoV在健康育肥猪及母猪的检出率中占比较大，表明隐性感染变得普遍，值得养殖户关注。除此之外，PSV的检出率远低于其他4种腹泻病毒。总之，随着2018年后养殖场加强生物安全防控措施和猪群管理，各病原检出率和阳性场检出率呈现逐年下降趋势。     

猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、A群轮状病毒和嵴病毒多重RTPCR检测方法的建立及临床应用

本研究建立了可同时检测猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）、传染性胃肠炎病毒（TransmissiblegastroenteritisVirus,TGEV）、A群轮状病毒（GroupArotavirus,GARV）和猪嵴病毒（Porcinekobu—virus）的多重RT—PCR方法。检测中,建立的多重RT—PCR方法能够检测到500Pg的TGEV、PEDV、GARV和猪嵴病毒等量混合RNA模板,与常规的单一RT—PCR检测结果基本相同（检测TGEV、PEDV、GARV和猪嵴病毒的灵敏性分别为1000A、1000／6、93．33％和96．67％,特异性均为i00％）。结果表明,建立的多重RTPCR方法敏感性和特异性良好,可作为临床上猪病毒性腹泻病因快速、高效的诊断工具。应用该方法对2010—2012年华中地区190份腹泻仔猪样本进行检测,PEDV、TGEV、GARV和猪嵴病毒的阳性率分别为62．11％、0．53％、7．37％和82．11％。混合感染方面,PEDV和猪嵴病毒混合感染率为47．89％,PEDV和GARV混合感染率为4．74％,GARV和猪嵴病毒混合感染率为7．37％,PEDV、GARV和猪嵴病毒混合感染率为4．74％,未发现TGEV与其它3种病毒的混合感染情况。另外,有27份样本中仅检出PEDV（14．21％）,57份样本只检出猪嵴病毒（30％）。分析表明,我国自2010年底大面积暴发的病毒性腹泻是多病原混合感染造成的,主要病原为PEDV,猪嵴病毒在其中所起作用尚待进一步验证和研究。     

猪腹泻相关肠道病毒分离研究进展

猪腹泻是全球养猪生产中最常见的疾病之一,病毒性腹泻具有传播快、致死率高和防控难的特点。常见的引起仔猪腹泻的病毒包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV),近几年新发现的猪δ冠状病毒(PDCoV)、猪嵴病毒(PKV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)也与仔猪腹泻相关。病毒分离是病毒感染诊断的金标准,也是进行病毒研究的前提。对上述6种常见猪肠道病毒的分离进展进行综述,可为掌握这些病毒的分离情况、疾病发展动向监测、疫苗研发以及猪腹泻病的防控提供参考。     

Etiological Investigation of Diarrhea in Newborn Piglets and Molecular Characterization and Genetic Variation Analysis of ORF3 Gene of PEDV in North Guangdong

In order to understand the main pathogen of newborn piglets diarrhea in North Guangdong region, 31 diarrhea samples were collected from six pig farms in North Guangdong, the pathogen of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and porcine rotavirus (PoRV) were detected by Real-time RT-PCR, meanwhile, ORF3 gene of PEDV amplified from positive samples were sequenced and analyzed. Pathogen detection results showed that 83.87%(26/31) samples were positive for PEDV, all herds and samples were negative for TGEV and PoRV. The sequence analysis revealed that the ORF3 gene of 5 epidemic strains of PEDV were all 675 bp, homologies of nucleotides were 98.7% to 100.0%, and homologies with reference sequences of nucleotides were 94.5% to 100.0%, and some gene mutation in common nucleotides site. The results of gene phylogenetic trees showed that PEDV could be divided into two groups, PEDV genetic relationship between field strains in North Guangdong and some regions in China, Southeast Asia, North America, Europe from 2013 to 2015 was closer, classed as a gene subgroup, from 2011 to 2012 main epidemic strains in our country and vaccine strains classed as other two gene subgroups. These results indicated that PEDV infection was the main pathogen of newborn piglets diarrhea in North Guangdong region, as time passed, the PEDV epidemic strains gene presented a tendency of evolution and variation.     

猪传染性胃肠炎与流行性腹泻病毒二重RT-PCR 检测方法的建立及应用

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)与流行性腹泻病毒(PEDV)的快速鉴别诊断方法,本研究根据GenBank已登录的TGEV核蛋白(N)基因和PEDV膜蛋白(M)基因保守区域序列分别设计了1对特异性引物,以TGEV和PEDV混合总RNA为反转录模板,建立了TGEV和PEDV的二重RT-PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了应用检测,并对检测到的阳性样品进行克隆测序。结果表明,成功建立了TGEV和PEDV二重RT-PCR检测方法,该方法的检测灵敏度最低极限为10 TCID₅₀/mL病毒含量,重复性好,特异性强,可特异性地扩增TGEV和PEDV细胞培养物,但对ST细胞和其他7种病原对照扩增不出任何条带;对22份临床疑似TGEV和PEDV感染样品检测结果与测序结果完全一致。本研究成功建立了TGEV与PEDV二重RT-PCR检测方法,可适用于猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病的快速鉴别诊断。