抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)的单克隆抗体(MAb),本试验将Vero细胞中增殖的PEDV超速离心纯化,作为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,采用常规的淋巴细胞杂交瘤技术和PEDV重组S蛋白为基础的间接ELISA方法,制备并筛选能稳定分泌PEDV特异性抗体的杂交瘤细胞;分别采用间接ELISA、Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验,对单克隆抗体的亚型、特异性等生物学特性进行鉴定。结果表明,本试验成功获得了1株稳定分泌PEDV特异性抗体的杂交瘤细胞株5C3。MAb亚类鉴定为IgM,轻链为k型。杂交瘤细胞连续传至20代,细胞培养上清液和小鼠腹水抗体效价分别稳定在1∶600和1∶10 000。特异性试验结果显示,MAb不与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪伪狂犬病毒(PrV)、猪圆环病毒(PCV2)发生交叉反应。western-blot结果显示,MAb能特异性识别PEDV的重组S蛋白。IFA试验结果表明,MAb能与PEDV感染的vero细胞产生特异性荧光。说明本试验获得的MAb能特异性识别重组及天然的PEDV S蛋白,具有良好的抗原性和特异性。     

2016-2020年华北地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查

利用RT-PCR方法对2016-2020年华北地区692份疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)临床样本进行检测,获得368份阳性样品,阳性率为53.18％,并对其进行了ORF5基因扩增和测序,开展遗传变异和分子流行病学分析.结果 显示,共获得33条完整的ORF5基因序列,除了HB-XT株为600 bp,其余全长均为603...     

漏缝地板发酵床对育肥羊养殖气体排放的影响及微生物学机理

为明确漏缝地板发酵床对育肥羊养殖过程氨（NH₃）和温室气体排放特征的影响机制,本研究设置地面和漏缝地板发酵床两个试验处理,测定分析了育肥羊养殖过程NH₃、氧化亚氮（N₂O）、二氧化碳（CO₂）和甲烷（CH₄）的排放特征,并采用宏基因组学解析了影响上述气体排放的微生物学机理。试验结果表明,与地面相比,漏缝地板发酵床能够显著降低育肥羊养殖过程的NH₃排放（P<0.05）,其NH₃排放速率为21.64~58.92 mg·m-2·h-1,NH₃累积排放量为86.36±1.06 g·m-2,减排率达58.60%。漏缝地板发酵床同样也能显著降低育肥羊养殖过程的CH₄排放速率（P<0.05）,其CH₄累积排放量为26.66 g·m-2,减排率可达64.42%。然而,漏缝地板发酵床会使得育肥羊养殖过程的N₂O和CO₂排放显著升高（P<0.05）,尤其是发酵床组的N₂O累积排放量高达994.30 mg·m-2,为地面的190.84倍。宏基因组学分析结果表明,发酵床粪便中Salinicoccus、Corynebacterium、Brachybacterium和Nocardiopsis等具有耐盐特性并参与硝化、反硝化的有益微生物相对丰度显著升高（P<0.05）,hcp、narG、nirK、norB、nosZ等氮转化关键基因相对丰度显著升高（P<0.05）,这使得发酵床的NH₃排放降低,但会造成较高的N₂O排放。发酵床中的Atopostipes和Anaerococcus等厌氧微生物相对丰度显著降低（P<0.05）,导致了其较低的CH₄排放。此外,发酵床较高的CO₂排放主要与微生物的丙酮酸代谢、三羧酸循环等密切相关。     

猪流行性腹泻病毒TaqMan检测方法的建立及基于S基因的遗传变异分析

旨在建立一种能快速、高效且灵敏的检测出猪流行性腹泻病毒（PEDV）的通用型TaqMan qPCR检测方法,并进一步了解河北省PEDV的遗传变异情况。本研究参考PEDV变异株AJ1102的M基因的保守区域设计特异性引物及探针,对引物浓度、退火温度等条件进行优化,建立了一种应用于猪场筛查PEDV的qPCR方法,并对筛查出的阳性样品S基因扩增测序后进行遗传进化分析。结果显示：该方法的特异性强,与猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）及传染型胃肠炎病毒（TGEV）等猪病常见病原均无交叉反应;建立的检测方法对pMD19T-PEDV标准品的最低检测下限为1.09×10¹拷贝·μL^-1,比普通PCR灵敏约100倍,敏感性高;组内和组间的变异系数均小于1%,重复性良好。基于S全基因成功克隆出的9条序列分布于GⅡ的两个亚群,克隆的9条序列的核苷酸相似性为96.6%～99.1%;氨基酸的相似性为94.6%～98.7%。结果表明：本研究得到的PEDV流行株与近年来国内分离株的关系较为密切,而与中国目前使用的疫苗株以及欧洲株亲缘关系较远,这表明河北部分地区PEDV当前流行毒株比较复杂且有变异的趋势,提示持续检测PEDV流行毒株变异动态的必要性。本研究不仅为PEDV的临床诊断提供了技术支持,更为进一步掌握PEDV遗传进化规律提供了参考依据。     

猪博卡病毒G1基因群和猪流行性腹泻病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立同时快速定量检测猪博卡病毒(PBoV)G1基因群和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的方法,本研究参照GenBank登录的PBoV的NP1基因和PEDV的M基因保守序列,设计了引物和探针,经优化反应条件后,建立了能够同时检测PBoVG1基因群和PEDV的双重TaqMan荧光定量PCR方法。特异性试验结果显示该方法与PCV2、PRV、PDCoV、PRoV和TGEV无交叉反应,敏感性试验结果显示该方法对PBoV、PEDV的质粒标准品检测下限分别为21.8拷贝/μL和31.7拷贝/μL;且组内、组间变异系数均小于4%,重复性好。应用本实验建立的方法对2017年5月~2018年8月,河北省部分地区采集的142份仔猪腹泻样品检测结果显示,PBoVG1阳性率为18.3%(26/142),PEDV阳性率为62.7%(89/142),其中PBoVG1与PEDV共感染率为10.6%(15/142),该方法优于常规PCR方法。本研究建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法对PBoV和PEDV的准确检测、病原监测、流行病学调查等均具有重要意义。     

河北省猪腹泻相关病毒的检测及猪流行性腹泻病毒S基因遗传变异分析

为了解当前河北地区猪腹泻主要相关病毒流行情况,对2016年4月—2017年2月收集的河北地区腹泻样品,采用荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒,并对扩增获得的9株PEDV S基因进行测序和序列分析。结果显示,全年腹泻病发生率为9.70%,在春冬季节多发。其中猪流行性腹泻病毒检出率最高,为13.89%,其在仔猪中检出率为19.28%,在育肥猪中检出率为17.24%。对PEDV S基因氨基酸序列分析显示,目前河北省PEDV流行毒株分布在G2群中的2个进化分支,部分毒株发生多处独特氨基酸突变。本研究表明,2016年河北地区PEDV对仔猪的感染情况有所缓解,而对育肥猪感染率较高,PEDV流行毒株S蛋白进化分支和突变较多提示PEDV流行毒株毒力和抗原活性可能发生改变。     

基于猪丁型冠状病毒重组S1蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

为了解猪丁型冠状病毒(PDCoV)的流行情况,为PDCoV血清抗体检测提供工具,本研究应用原核表达系统表达部分PDCoV纤突蛋白(S)作为检测抗原,建立了基于PDCoV S1蛋白的间接ELISA抗体检测方法,并用该方法检测了2017年1月至12月自河北地区部分猪场收集的待检血清样品570份。结果显示:本研究建立的PDCoV间接ELISA方法能够特异地检测血清中的PDCoV抗体;与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒及伪狂犬病病毒的抗血清无交叉反应;批内重复变异系数1.9%～5.4%、批间重复变异系数2.3%～5.1%。570份待检血样中105份呈阳性,阳性率为18.4%(105/570),高于之前本实验室检测2016年1月至2016年10月河北地区PDCoV IgG抗体阳性率(11%),提示河北地区PDCoV的感染率呈上升趋势。本研究建立的ELISA方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的优点,可用于临床PDCoV血清抗体的检测。     

牛胚胎性别鉴定荧光定量PCR方法的优化与应用

旨在建立一种可检测牛早期胚胎性别的复合探针体系,减少常规PCR方法电泳所带来的污染,提高鉴定准确率,降低鉴定成本。本研究以SRY为牛胚胎性别鉴定的目标基因,以进口YCD-PCR性别鉴定试剂盒为对照组（n=9 543）,荧光定量PCR的单引物分别扩增体系（荧光单扩,FSPSA,n=6 570）和双引物混合扩增体系（荧光双扩,FDPMA,n=22 238）分别做试验组,从性别鉴定效率、无反应率、雌雄胚胎百分率和比值、移植妊娠率、雌性胚胎母犊率、不同细胞取样数下的性别鉴定结果和鉴定成本等方面进行各组间比较。结果表明,荧光单扩组的雌性胚胎百分率和性别鉴定效率极显著高于其他两组（P<0.01）,无反应率极显著低于其他两组（P<0.01）,雌雄胚胎比值与其他两组差异较大（1.03∶1 vs 1∶1.03和1∶1.02）,雌性胚胎母犊率极显著低于荧光双扩组和对照组（P<0.01）;荧光双扩组的雌性胚胎百分率、雄性胚胎百分率和雌性胚胎母犊率均与对照组无显著差异（P>0.05）,雌雄胚胎比值与对照组相似（1∶1.03和1∶1.02）,无反应率极显著低于对照组（P<0.01）,性别鉴定效率极显著高于对照组（P<0.01）。取样细胞4~6组和7~10组的性别鉴定效率极显著高于1~3组和SD（separated & died cells）组（P<0.01）,而1~3组和SD组之间及4~6组和7~10组之间差异不显著（P>0.05）。移植妊娠率4~6细胞组最高（49.68%）,但各取样组间无显著差异（P>0.05）。荧光双扩法与对照组相比,鉴定成本下降了46.76%。结果显示,荧光双扩方法产母犊准确率最高,鉴定成本较低,取样4~6细胞时的移植妊娠率最高,是一种更可行的牛胚胎性别鉴定技术,更有利于产业化推广和应用。     

河北部分地区致犊牛腹泻大肠杆菌的分离鉴定与耐药性及系统进化发育分析

正随着养牛业规模的不断扩大,牛场引进犊牛数量的增多,犊牛腹泻的发病率和死亡率有着明显的上升趋势。许多病原微生物均可导致犊牛腹泻,其中大肠杆菌是主要致病菌,占90%以上,大肠杆菌引起犊牛的肠道疾病,初期症状为腹泻、脱水,严重时甚至会引起死亡,牛场内一旦发生该病,将严重影响犊牛生长、发育、产能,对养牛业的发展和经济效益造成严重的损失。     

河北省畜禽种业“十二五”发展思路及重点

畜禽良种在畜牧生产中所起的作用是任何因素所不可取代的,畜牧生产的每一次突破和跨越都是以良种革命为先导的。畜禽种业是由种畜禽企业、配种改良网络和性能测定三部分组成。从一定意义上讲,畜牧业的竞争就是畜禽良种的竞争,