大肠杆菌K88ac—STl—LTB三价基因工程菌株的构建

利用PCR技术，从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K88ac基因、ST1突变基因和LTB基因，通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化，构建了合K88ac—ST1—LTB融合基因表达载体的重组菌株BL2l(DE3)(pXKST3LT5)。经酶切鉴定和DNA序列分析证实，构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac—ST1-LTB融合基因，是基因序列和阅读框架均正确。免疫试验结果表明，K88ac—ST1—LTB融合蛋白能够诱发机体产生抗体，该抗体具有中和天然STl肠毒素毒性的作用。用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗2MLD的大肠杆菌强毒株C83902(K88ac，ST^ ，LT^ )的攻击。由此表明，构建的工程菌株BL2l(DE3)(pXKST3LT5)可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻的基因工程菌苗的候选株。     

大肠杆菌K88ac-ST1-LTB三价基因工程菌株的构建

利用PCR技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K88ac基因、ST1突变基因和LTB基因,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建了含K88ac-ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株BL21(DE3)(pXKST3LT5).经酶切鉴定和DNA序列分析证实,构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac-ST1LTB融合基因,且基因序列和阅读框架均正确.免疫试验结果表明,K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够诱发机体产生抗体,该抗体具有中和天然ST1肠毒素毒性的作用.用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠,结果免疫小鼠至少能抵抗2 MLD的大肠杆菌强毒株C83902(K88ac,ST+,LT+)的攻击.由此表明,构建的工程菌株BL21(DE3)(pXKST3LT5)可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻的基因工程菌苗的候选株.     

大肠杆菌耐热性肠毒素ST Ⅰ突变体与黏附素K99融合基因的构建及其表达

采用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌C83922质粒中扩增出耐热性肠毒素(ST Ⅰ)和黏附素K99基因片段,进一步结合基因重组技术成功构建了含有融合基因ST Ⅰ-Linker-K99的重组质粒pMSLK;通过PCR和寡核苷酸定点突变技术将ST Ⅰ毒素中心的6个Cys分别突变成Ser和Gly,经亚克隆后将含有突变位点的融合基因插入到pET-20b表达栽体中,获得了重组质粒pES(S)LK和pES(G)LK;将以上2种质粒分别导入到BL21(DE3)菌株中,成功构建BL21(DE3)(pES(S)LK)和BL21(DE3)(pES(G)LK)2种重组菌株,对其表达产物进行SDS-PAGE和免疫印迹分析.结果表明:这两种重组菌株都能高效表达ST Ⅰ突变体与K99的重组蛋白,而且表达的融合蛋白能够被产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922抗血清特异性识别.     

仔猪大肠杆菌K88ac-ST1-LTB三价基因工程灭活苗的研究Ⅰ.基因工程菌株BL21(DE3)(pXKST3LT5)菌种的限定代次及保存条件试验

产肠毒素性大肠杆菌所致的仔猪黄、白痢在我国广大养殖地区流行十分广泛,发病率和死亡率都很高,即便是病愈存活的仔猪,其生长发育和生产性能指标也会受到严重影响,给养猪业造成了极其严重的经济损失.我们利用基因工程技术将大肠杆菌菌毛K88ac抗原基因与肠毒素ST1和LTB基因融合在一起,获得了高效表达K88ac-ST1-LTB融合蛋白的基因工程菌株,所表达的产物,既保持了K88ac菌毛抗原和LTB肠毒素良好的免疫原性,又赋予了ST1的免疫原性,同时在构建过程中,通过定点突变使ST1丧失了原有的生物毒性,这样就可以从菌毛和肠毒素两种途径来达到免疫预防的目的[6].本试验对用于生产仔猪大肠杆菌K88ac-ST1-LTB三价基因工程灭活苗的基因工程菌株BL21(DE3)(pXKST3LT5)菌种的使用限定代次及保存条件进行了系统的研究,为研制仔猪大肠杆菌K88ac-ST1-LTB三价基因工程灭活苗提供了重要参数.     

表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白的工程菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原，免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗2MLD的大肠杆菌强毒株C83902（K88ac,ST^ ,L^ )的攻击，用提取的包涵体免疫家兔后，采集的血清能够中和天然ST1的毒性，这表明构建的工程菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。     

鸡致病性大肠杆菌O1、O2和O78的Ⅰ型菌毛结构基因表达载体的构建及表达产物的检测

用限制性内切酶SacI和BamHI双酶切克隆有鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的piliA基因的质粒pTFimO1、pTFimO2和pTFimO78,分别回收从此3质粒上切下的545bp的piliA基因片段,再将载体pET-28a(+)用SacI和BamHI双酶切,最后将pET-28a(+)DNA片段与545bp的piliA DNA片段进行连接,转化至受体菌BL21(DE3)中,经SacI和BamHI酶切反应鉴定重组子,得到了理想重组子质粒pETFimO1、pETFimO2和pETFimO78.重组菌株BL21(DE3) (pETFimO1)、BL21(DE3)(pETFimO2)和BL21(DE3)(pETFimO78)经IPTG诱导后,其表达产物经SDS-PAGE检测,结果表明重组菌株可以良好地表达鸡致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛蛋白.     

产肠毒素大肠杆菌肠毒素LTB、STI和STⅡ融合基因的构建与表达研究

PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,FTEC)LTB、STI、STⅡ基因，将LTB、STI、STⅡ基因重组入pET32a质粒载体，对构建的重组质粒pBST进行酶切分析、PCR检测以及核苷酸序列分析，结果表明，插入片段LTB－STⅡ－STI的核苷酸序列与预期一致，且阅读框正确。pBST在宿主菌BL21（DE3）RIL中的表达产物经SDS－PAGE初步分析，显示重组融合蛋白的分子量约为40kD，其表达量约占菌体总蛋白的46％。     

产肠毒素大肠杆菌肠毒素LTB、STⅠ和STⅡ融合基因的构建与表达研究

PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)LTB、STⅠ、STⅡ基因,将LTB、STⅠ、STⅡ基因重组入pET32a质粒载体,对构建的重组质粒pBST进行酶切分析、PCR检测以及核苷酸序列分析,结果表明,插入片段LTB-STⅡ-STⅠ的核苷酸序列与预期一致,且阅读框正确.pBST在宿主菌BL21(DE3)RIL中的表达产物经SDS-PAGE初步分析,显示重组融合蛋白的分子量约为40kD,其表达量约占菌体总蛋白的46%.     

大肠杆菌K99-ST1双价基因工程菌株的构建及其免疫原性

为了有效预防肠毒素性大肠杆菌引起的犊牛和羔羊腹泻,利用基因工程技术构建了融合基因K99-ST1及其原核表达载体,并时融合蛋白进行了初步免疫原性分析.结果显示,将PCR获得的K99菌毛抗原基因和人工合成的ST1基因片段借助pUCm-T载体,成功构建重组质粒pUCm-K99-ST1,从而获得融合基因K99-ST1;使用EcoRⅠ+SalⅠ双酶切将该融合基因定向插入表达载体pET30a中,成功构建表达载体pET-K99-ST1;将该表达载体转入表达菌株BL21(DE3)中,经IPTG诱导得到大小约31 000的蛋白;Western blotting显示,融合蛋白可以特异的与K99阳性血清反应;将BL21(DE3,pET-K99-ST1)诱导表达后免疫兔,ELISA检测K99抗体水平较高,乳鼠灌胃试验显示该菌株免疫后产生ST1抗体.这表明本试验已成功构建大肠杆菌K99-ST1双价基因工程菌株BL21(DE3,pET-K99-ST1),该菌株具有良好的免疫原性,为大肠杆菌K99-ST1双价基因工程疫苗开发奠定了基础.     

鸡致病性大肠杆菌O1、O2和O78的I型菌毛结构基因表达载体的构建及表达产物的检测

用限制性内切酶SacI和BamHI双酶切克隆有鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的piliA基因的质粒pTFimO1、pTFimO2和pTFimO78，分别回收从此3质粒上切下的545bp的piliA基因片段，再将载体pET-28a( )用SacI和BamHI双酶切，最后将pET-28a( )DNA片段与545bp的piliA DNA片段进行连接，转化至受体菌BL21（DE3）中，经SacI和BamHI酶切反应鉴定重组子，得到了理想重组子质粒pETFimO1、pETFimO2和pETFimO78。重组菌株BL21（DE3），（pETFimO1)、BL21（DE3）（pETFimO2)和BL21（DE3）（pETFimO78)经IPTG诱导后，其表达产物经SDS－PAGE检测，结果表明重组菌株可以良好地表达鸡致病性大肠杆菌I型菌毛蛋白。     

CPA-LTB融合基因的构建与表达

利用PCR技术，从A型产气英膜梭菌染色体和pEWD299中分别扩增出a毒素（CPA）基因和LTB基因，通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化，构建了含CPA—LTB融合基因表达质粒的重组菌株BL21（DE3）（pCPA—LTB）。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实，构建的重组质粒pET—CPA含有CPA—LTB融合基因，其基因序列和阅读框架均正确。经EISA检测和SDS—PAGE分析，重组菌株表达的CPA—LTB融合蛋白能够被α、LT毒素抗体所识别。重组菌株BL21（DE3）（pCPA—LTB）经IPTG诱导后，融合蛋白CPA—LTB的表达量占菌体总蛋白相对含量的12.5％。     

犬瘟热病毒N基因原核表达及多克隆抗体的制备

采用PCR方法扩增犬瘟热病毒N基因,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建犬瘟热N基因原核表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达重组N蛋白。从包涵体中纯化重组蛋白,制备多克隆抗体,采用Western blot检测其特异性。结果显示PCR扩增得到犬瘟热N基因,重组N蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到表达,制备的多克隆抗体能与N蛋白特异性反应。     

大肠杆菌热敏肠毒素B亚基的原核表达及其免疫增强作用的探讨

从大肠杆菌K88(LT+,ST+)菌株中扩增热敏肠毒素B亚基基因,得到454bp的片段,AT克隆后,定向连接到pET32a(+)中,并转化入大肠杆菌BL21(code plus),通过IPTG 30℃诱导,表达了重组的LTB.SDS-PAGE电泳显示,其分子量约为34KD左右,主要存在于包涵体中,且复性后保留部分生物学活性.动物实验证明LTB与CpG共同作用,可显著增强豚鼠对口蹄疫疫苗的免疫反应.     

大肠杆菌热敏肠毒素B亚基的原核表达及生物学活性分析

从大肠杆菌K88（LT＋,ST＋）菌株中扩增热敏肠毒素B亚基基因（ltb）,得到454 bp片段,克隆至pMD18-T载体后,与pET32a（＋）定向连接,并转化入大肠杆菌BL21中,用IPTG 30℃诱导表达重组LTB蛋白。SDS-PAGE显示,重组蛋白分子量约为34 kDa,超声波裂解后,表达产物主要以包涵体形式存在。经鉴定,纯化复性后的LTB蛋白保留部分与GM1结合的生物学活性。     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体基因的表达

将 2种抗 A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体 ( Sc Fv)基因 Sc Fv-2 E3和 Sc Fv-1 A8克隆至表达载体p UC1 1 9、p HOG2 1和 p ET2 0 b中 ,构建了重组质粒 p UC2 E3和 p UC1 A8、p HOG2 E3和 p HOG1 A8、p ET2 E3和 p ET1 A8后 ,分别转化至受体菌 JM1 0 5、JM1 0 9和 BL2 1 ( DE3 )中 ,得到重组菌株 JM1 0 5( p UC2 E3 )和JM1 0 5( p UC1 A8)、JM1 0 9( p HOG2 E3 )和 JM1 0 9( p HOG1 A8)及 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET2 E3 )和 BL2 1 ( DE3 )( p ET1 A8)。 ELISA检测表明 ,经 IPTG诱导后所表达的目的蛋白存在于重组菌株 JM1 0 5( p UC2 E3 )和JM1 0 5( p UC1 A8)及 JM1 0 9( p HOG2 E3 )和 JM1 0 9( p HOG1 A8)的菌培养上清中 ,在重组菌株 BL 2 1 ( DE3 )( p ET2 E3 )和 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET1 A8)的胞周质中检测到了 Sc Fv的存在。 SDS-PAGE和薄层扫描分析表明 ,重组菌株 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET2 E3 )和 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET1 A8)的蛋白表达产物分别占菌体可溶性蛋白的 0 .9%和 0 .7%,其大小约为 2 60 0 0 ,且表达的目的蛋白具有中和磷脂酶 C的活性。     

中国黄牛PrPc成熟蛋白的原核表达和抗原性分析

将中国黄牛PrPc 成熟蛋白基因重组质粒b -pET11a -PrPc(本室构建 )转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达。SDS -PAGE电泳显示表达产物的分子量约为23KD ,大小与预计相符 ;免疫印迹 (WesternBlotting)试验进一步证实 ,中国黄牛PrPc 成熟蛋白获得了正确的表达 ,且与大肠杆菌BL21(DE3)具有共同抗原成分     

人MxA基因的原核表达及其抗血清的制备

本试验旨在利用大肠杆菌BL21(DE3)表达MxA融合蛋白pET32a(+)-MxA,制备兔抗人MxA抗血清。采用PCR技术获得MxA基因,然后将MxA基因重组到pET32a(+)载体中,筛选阳性克隆,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,用超声波裂解重组菌BL21(DE3)培养物,纯化蛋白质后免疫新西兰兔制备抗血清。SDS-PAGE分析结果显示,pET32a(+)-MxA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以包涵体形式高效表达;获得的抗血清经间接ELISA法检测效价为1∶6400;Western blotting检测结果显示,抗血清可与真核表达的MxA蛋白进行特异性结合。试验结果表明,在大肠杆菌中成功表达了pET32a(+)-MxA融合蛋白,制备了具有高度特异性的兔抗人MxA抗血清,这样为采用酶标法测定病毒患者全血细胞或由干扰素诱导的细胞产生的MxA蛋白质含量及临床诊断试剂盒的开发和应用打下了基础。     

3拷贝鸡胸腺素α1基因在大肠杆菌中的融合表达及活性分析

为表达鸡胸腺素α1(Thymosin alpha 1,Tα 1),并对其进行纯化及生物学活性分析,本研究根据大肠杆菌基因密码子偏嗜性对Tα 1基因进行优化,人工合成了Tα1三拷贝融合基因.并将其克隆至原核表达载体pET-30a中,转化至BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达和镍柱纯化,获得融合蛋白.融合蛋白经羟胺切...     

大肠杆菌O157 Z4182基因的克隆与表达

根据大肠杆菌0157z4182基因设计1对引物，并在其5'端分别加入NcoI、XhoI酶切位点，用聚合酶链反应（PCR）从本试验用的大肠杆菌O157及1株产志贺毒素大肠杆菌（STEC）08、1株肠道聚集粘附大肠杆菌（EAggEC)和1株产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）菌株中也扩增出了803BP的DNA片段。以大肠杆菌0157菌株94H的DNA为模板，用上述引物做PCR，将其产物连接到载体质粒pET28a( )，然后转化到宿主菌大肠杆菌LE392，从该菌中提取重组质粒，再将其转化到表达宿主大肠杆菌BL21（DE3），用PCR，限制性内切酶位点分析及核苷酸序列测定法对克隆的重组质粒进行鉴定，表明Z4182基因定向克隆到了载体质粒Pet28a( )。将转化子培养并经IPTG诱导后，做SDS-PAGE电泳，表明该菌株可以表达Z4182基因。本试验为阐明大肠杆菌O157Z4182基因的分布及探讨该基因产物的功能和致病作用奠定了基础。     

大肠杆菌志贺毒素stxB融合基因的构建及其高效表达

利用PCR方法，从肠出血性大肠杆菌O157：H7的基因组DNA中，分别扩增出Stx1B和Stx2B亚基的结构基因片段，然后再通过PCR将这2个片段连接起来，并定向克隆到表达质粒pET28a的Nco1和EcoR 1位点之间，构建了重组表达质粒pMB1。将重组质粒转化到宿主菌BL21(DE3)中，对重组菌株BL21(pMB1)用IPTG进行诱导表达，并对最佳诱导时间进行了探索。SDS-PAGE电泳检测结果表明。重组菌株表达出了16300的目的蛋白Stx2B-L-Stx1B；经薄层扫描分析表明，表达量约占菌体总蛋白的68．4％，且目的蛋白为包涵体表达，表达量约占细菌沉淀的84．6％。研究还表明，未用IPTG诱导的BL21(pMB1)菌株也可有少量目的蛋白的基础表达。不同诱导时间的结果表明，在3～7h的诱导时间内，目的蛋白的表达量没有明显变化。