伊犁河谷区域银盾革蜱的鉴定及其携带马泰勒虫病原DNA检测

为了解伊犁河谷区域银盾革蜱的分布及其携带马泰勒虫病原情况,通过对银盾革蜱形态学及革蜱属特异性基因(ITS-2)和其携带病原18S rRNA基因PCR扩增及其PCR产物的克隆、测序、同源性比较等,鉴定和检测了采自昭苏种马场马体表银盾革蜱及其携带病原情况。试验结果显示,采回的蜱经形态学鉴定均为银盾革蜱,PCR扩增银盾革蜱ITS-2基因和马泰勒虫18S rRNA基因序列大小分别为825 bp和789 bp。本试验蜱获得的ITS-2序列与已发表的伊朗株(GQ144706.1)同源性为99%,与形态学鉴定结果一致,故鉴定为银盾革蜱。在181只银盾革蜱中携带马泰勒虫的有13只,阳性率为7.1%(13/181),且其携带病原目的基因序列与Gen Bank中已发表的马泰勒虫基因序列相似性为99%。研究表明,结合形态学分类和分子生物学方法对银盾革蜱鉴定具有简易、准确度高等特点,且分离银盾革蜱源性病原更有实际意义,为综合防控奠定了基础。     

基于18S rRNA基因测序基础上的锥虫分子分类学

利用18S rRNA基因序列分析方法,对我国湖北、广西、新疆和浙江4省的伊氏锥虫及1株布氏锥虫进行分子分类学研究.用分离的锥虫感染实验动物,自感染小鼠的红细胞或全血中提取基因组DNA,根据GenBank中已发表的雏虫18S rRNA序列设计1对锥虫通用引物,通过PCR扩增目的基因片段,将扩增产物连接到pGEM-T载体中,经酶切、PCR确定,进行序列测定.结果显示,7个锥虫分离株的18S rRNA基因大小为2 188 bp.利用DNAS-tar对试验所获得的这7株锥虫和GenBank中部分锥虫的18S rRNA基因进行比较分析,建立2个进化系统发生树.核苷酸同源性比较及系统发生树显示:自我国上述4省分离的伊氏锥虫来源于同一株系,布氏锥虫和广西分离的伊氏锥虫株的18S rRNA核苷酸与其他锥虫分离株仅有较小差异,与国外的6株锥虫的同源性为99%～100%,与另外7株的同源性为62%.     

华南虎源大肠杆菌的快速鉴定及致病特性的初步研究

从患病华南虎分离病原菌,进行快速鉴定,同时以大肠杆菌16S rRNA基因的通用引物和irp2、papC、iucD、tsh、iss毒力基因的特异性引物进行PCR扩增、测序,并将扩增出来的irp2、iucD、iss基因序列与Genbank相应序列进行同源性分析。测序鉴定为大肠埃希氏菌,与传统细菌鉴定方法结果相一致,分离菌携带irp2、iucD、iss毒力基因,从毒力试验得到证实。其序列与Genbank上发表的iucD、iss基因序列同源性分别高达98%、99%,而irp2基因序列的同源性仅为48%。采用16S rRNA基因序列分析法可以对华南虎大肠埃希氏菌感染进行快速鉴定,华南虎源性大肠杆菌同时携带有irp2、iucD、iss 3个毒力基因,可能与其致病性有关系。     

新疆小亚璃眼蜱的鉴定及其携带牛环形泰勒虫病原DNA检测

通过对璃眼蜱形态学及璃眼蜱属特异性基因(ITS-2)和其携带病原基因(Tams1)PCR扩增及其PCR产物的克隆、测序、同源性比较等,鉴定和检测采自新疆吐鲁番地区疑似牛体表璃眼蜱(n=50)及其携带病原状况。结果显示,采集的蜱虫经形态学鉴定均为小亚璃眼蜱,PCR扩增的璃眼蜱种属特异性ITS-2基因和环形泰勒虫Tams1基因序列大小分别为491 bp和534 bp。本试验获得的ITS-2序列与Gen Bank中已记载的小亚璃眼蜱ITS-2序列一致,与形态学鉴定结果相符,故这些璃眼蜱属于小亚璃眼蜱种(Hyalomma anatolicum)。在检测的50只璃眼蜱中,携带牛环形泰勒虫的有3只,阳性率为6%(3/50),并发现所扩增的携带病原目的基因序列与已登录记载的牛环形泰勒虫基因序列相似性为99%。结果表明,在传统形态学分类的基础上,借助分子生物学方法对璃眼蜱种属鉴定及无典型硬蜱种的鉴定具有简易、准确度高等特点,而且在璃眼蜱种属确定的基础上分离其携带的病原更有实际意义。     

羊泰勒虫吉林省分离株18S rRNA基因的克隆和序列分析

为分析羊泰勒虫吉林省分离株的18S rRNA基因序列,根据羊泰勒虫18S rRNA基因的保守区序列设计1对引物,对吉林省的绵羊血液基因组DNA进行PCR扩增,结果扩增出长度为459 bp的基因片段,并成功地将该基因克隆到pMD18-T载体。将经纯化、筛选及酶切鉴定和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序,与已发表的羊泰勒虫基因序列进行比较。序列分析显示,羊泰勒虫吉林省分离株与羊泰勒虫China 1的同源性为100%。     

黑颈鹤源大肠杆菌的快速鉴定及致病特性的初步研究

对黑颈鹤病原菌进行快速鉴定及毒力因子分析。采用16S rRNA序列分析法鉴定黑颈鹤病原菌,其毒力基因分别用大肠杆菌的irp2、papC、iucD、tsh、iss毒力基因的特异性引物进行PCR检测,并将扩增出来的irp2基因序列与Genbank~（TM）相应序列进行同源性分析。分离菌株鉴定为大肠埃希氏菌,鉴定结果与生化检测结果一致,分离菌携带irp2毒力基因,这从毒力试验得到证实,其序列与与Genbank~（TM）上发表的HPI irp2基因序列同源性高达98%以上。采用16S rRNA序列分析法可以对黑颈鹤大肠埃希氏菌感染进行快速鉴定,黑颈鹤源性大肠杆菌携带有irp2毒力基因。     

伊氏锥虫、马媾疫锥虫、布氏锥虫、刚果锥虫的18S rDNA部分序列测定与系统发育关系

对伊氏锥虫（Trypanosoma evansi）：新疆株（XJCA）、湖北株（HBM）、云南株（YNB）、广东株（GDB2）；马媾疫锥虫（Trypanosoma equiperdum）、布氏锥虫（Trypanosoma brucei）、刚果锥虫（Trypanosoma congolense）提取基因组DNA，根据已报道的伊氏锥虫株18SrDNA基因序列设计合成引物，用PCR扩增了锥虫虫株基因组DNA,伊氏锥虫新疆株、湖北株、云南株、广东株、布氏锥虫、刚果锥虫均为373bp的片段；马媾疫锥虫为372bp的片段，PCR产物经电泳鉴定后用试剂盒回收纯化，纯化后PCR产物经连接、转化后测序，将测得的序列用DNAMAN软件分析并与国外已发表的相应序列进行了同源性比较，并绘制了系统发育进化树。结果与国外AJ009153、AJ223564、D89527株同源性达到99％～100％，与另外11株同源性75％。本研究为锥虫分子流行病学研究及分类研究打下基础。     

奶牛温氏附红细胞体16S rRNA基因的克隆及系统进化分析

无菌采集感染温氏附红细胞体(E.wenyoni)的牛血液,抽提E.wenyoni基因组DNA,参考GenBank发表的E.wenyoni 16S rRNA基因序列(AF016546),设计1对特异性引物,扩增并克隆E.wenyoni 16S rRNA部分基因,基因产物大小为1 005 bp.序列比较结果显示,所测序列与参考序列(AF016546)同源性最高.达97.9%.系统发育分析表明,所测序列与支原体属病原代表种的序列接近.同源性约为70%,而与无浆体科病原代表种的序列相差较远,同源性约为50%.可见,E.wenyoni应归为支原体属,而不应属于立克次氏体目、无浆体科.     

两株水牛伊氏锥虫内转录间隔区基因序列的测定与系统进化关系

为研究从水牛分离到的伊氏锥虫广西株和湖北株的分类学地位,对2株伊氏锥虫的核糖体基因内转录间隔区(ITS1-5.8S-ITS2)基因进行了克隆和测序分析.用CLUSTALXl.83软件多重比对分析了序列差异,应用MEGA4.0软件绘制系统进化树.结果表明,这2株水牛伊氏锥虫的ITS1-5.8S-ITS2 rRNA基因扩增产物分别为1 102 bp和1 095 bp,序列存在多态性,其中广西株的ITS-1序列长为340 bp,ITS-2序列长为582 bp,湖北株的ITS-1序列长为339bp,ITS-2序列长为587 bp.系统进化分析显示,这2株伊氏锥虫分布在同一大枝的不同亚群中.     

奶牛附红细胞体和伊氏锥虫二重PCR诊断方法的建立

为建立奶牛附红细胞体和伊氏锥虫两种病原诊断方法并探索二者之间在奶牛感染中的关系,本研究针对两病原分别设计两对特异性引物,建立了奶牛附红细胞体和伊氏锥虫感染的二重PCR诊断方法,其扩增片段大小分别为415bp和237bp。敏感性试验和特异性试验表明,附红细胞体和伊氏锥虫的DNA的最低检测量为0.154pg和0.105pg;与猪肺炎支原体、大肠杆菌、葡萄球菌、鸡艾美耳球虫、牛双芽巴贝斯虫无交叉反应。35份临床血样检测结果为:奶牛附红细胞体阳性率22.89%,伊氏锥虫阳性率8.89%,其中共感染率为2.89%。临床试验表明,该方法可用于奶牛附红细胞体和伊氏锥虫的诊断,特别适用于早期诊断。     

环形泰勒虫与牛无浆体双重PCR方法的建立

旨在建立快速检测环形泰勒虫和牛无浆体的双重PCR方法,调查吐鲁番地区这2种病原感染情况。根据NCBI库中上传的环形泰勒虫Spm2、Tams1基因和牛无浆体16S rRNA基因保守序列设计、合成3对特异性引物,使用PCR扩增并测序。根据Spm2和16S rRNA基因设计双重PCR并对反应体系及条件进行优化,对该方法进行特异性、灵敏性和重复性检测,建立一种双重PCR方法。结果显示,双重PCR方法特异性扩增出环形泰勒虫和牛无浆体相应目的片段,片段大小分别为853,351 bp,而驽巴贝斯虫、马泰勒虫、绵羊无浆体和伊氏锥虫均未扩增出条带。对环形泰勒虫Spm2、Tams1和牛无浆体16S rRNA基因序列进行系统发育分析,环形泰勒虫Spm2基因序列与印度株同源关系最近(MH844677)、Tams1基因序列与突尼斯株同源关系近(AF214899),牛无浆体16S rRNA基因序列与突尼斯株同源关系近(KY655808)。此方法能检测环形泰勒虫与牛无浆体最低浓度分别为2.9×10^-16,1.8×10^-19 g/μL。用该方法对临床60份牛血DNA进行双重...     

湖南省牛无浆体虫株分子生物学鉴定

用原虫16 S rRNA基因序列通用引物对湖南5个地区牛无浆体感染的阳性血液样品进行PCR扩增,经测序和序列拼接,获得5个无浆体样品16 S rRNA基因的部分序列,应用分子生物学软件进行分析,并根据所获得序列的保守区间设计特异性引物,进行PCR诊断方法的探讨性研究.结果表明,在通用引物下,5个地区无浆体感染的阳性血液样品均获得1 425 bp大小的虫体16 S rRNA基因条带;测序后5个无浆体16 S rRNA序列同源性均在97%～98%.证明5个分离虫株初步鉴定为牛边缘无浆体.     

鸭疫里氏杆菌吉林分离株16S rRNA系统分析及其OmpA基因克隆

为研究鸭疫里氏杆菌(RA) 16S rRNA变异与OmpA基因之间的关系,提取了RA吉林分离株JL-RA1和JL-RA3总DNA,并设计特异性引物扩增两株RA保护性抗原OmpA全基因序列.结果显示,扩增出的16S rRNA序列大小均为1478 bp,OmpA片段序列大小均为1164 bp,与预期结果一致.扩增的16S rRNA与GenBank中已知的RA 16S rRNA序列同源性高达99.0％ ～99.9％,扩增的OmpA序列与GenBank中已知的RA OmpA序列同源性达93.3％ ～ 100％,编码蛋白质的氨基酸序列同源性为96％～100％.     

鲤鱼双线绦虫裂头蚴的分子鉴定和系统发育关系分析

为了鉴定天津市某养殖场鲤鱼腹腔内寄生的“面条样”虫体，本试验通过PCR方法扩增虫体的18S rRNA、COⅠ和COB基因序列，并进行分子鉴定和基因测序，分析3种基因的同源性、分子进化和系统发育关系。结果显示，寄生于鲤鱼体内的虫体的18S rRNA、COⅠ和COB基因序列分别与双线绦虫分离株MN204040.1(中国)、MN219466.1(中国)和EU241209.1(法国)的核苷酸序列同源性较高，为99.45%、98.74%和99.26%。基于18S rRNA、COⅠ和COB基因序列构建的系统发育树显示，本试验分离的绦虫裂头蚴与GenBank数据库中已鉴定的双线绦虫聚在同一分支上，且与双线绦虫中国武汉分离株的种属亲缘关系较近。本试验初步阐明获得的天津市双线绦虫分离株与其他种属之间的系统发育关系，为双线绦虫的分子鉴定和系统发育关系分析提供了数据支持。     

猪鼻支原体的分子鉴定及进化分析

本研究对青藏高原地区青海猪鼻支原体分离株(Mhr-QH1)进行了Mhr-p37基因的克隆鉴定及测序分析,并利用Mhr-16S rRNA基因与Gen Bank中相关菌株基因进行了基因同源性比较和遗传进化分析。Mhr-p37基因和16S基因PCR扩增测序结果显示,获得核苷酸序列长度分别为346bp和1500bp,Mhr-QH1-p37基因核苷酸序列与中国株、法国株和美国株的同源性达到100%;同样16S rRNA基因与巴西分离株的16S rRNA基因同源性也为100%,与日本、瑞典和美国分离株的同源性为99%。进化树分析发现:Mhr-QH1分离株与巴西株聚为组成一个微小分支,与美国株和巴西株共聚为同一个大支上,并与其他Mycoplasma spp.种系进化距离较远。因此,本研究对青海猪鼻支原体菌株的Mhr-p37基因序列和蛋白氨基酸序列分析,及16S rRNA基因系统进化研究的结果,有望为我国猪鼻支原体病的分子流行病学调查提供一定的数据参考,同时提示猪场搞好饲养管理是预防本病的关键。     

牛支原体新疆株的分离鉴定

为调查新疆规模化奶牛场病牛死亡原因并确定病原,本研究无菌采集7份肺炎病死牛病变肺组织样,通过牛支原体液体培养基和固体培养基分离到1株支原体,采用形态学观察和生化试验鉴定该分离株,采用支原体特异性引物和牛支原体16S rRNA通用引物扩增基因序列并测序,使用DNAStar软件将分离菌株测序结果与GenBank中的标准株序列进行同源性比对,采用Mega 6.0软件中的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)依据16S rRNA序列构建分离株系统进化树。结果显示,分离株菌落呈典型的"煎蛋样",菌落中心凹陷深入培养基,周边菲薄而透明,经Dienes染液染色后,菌落中心呈深蓝色。该分离株不分解葡萄糖、尿素、不水解精氨酸,血细胞吸附试验和溶血试验均呈阴性,氯化三苯基四氮唑还原反应呈阳性,产生膜和斑。PCR反应扩增出大小为1 911 bp的牛支原体特异性目的片段;分离株16S rRNA基因序列与牛支原体标准株PG45的序列同源性为99.8%,与牛支原体地方株(Mb NM2012、Mb HB0801、Mb Hubei-1、Mb Ningxia-1、Mb CQ-W70和Mb 08M)的同源性为99.3%～99.7%。系统进化树显示,分离株16S rRNA基因与Mb Ningxia-1株和Mb 08M株亲缘关系较近,处于同一分支。本研究结果证实了引起病牛死亡的病原为牛支原体,为新疆牛支原体病的防治提供了科学依据。     

牛支原体新疆株的分离鉴定

为调查新疆规模化奶牛场病牛死亡原因并确定病原,本研究无菌采集7份肺炎病死牛病变肺组织样,通过牛支原体液体培养基和固体培养基分离到1株支原体,采用形态学观察和生化试验鉴定该分离株,采用支原体特异性引物和牛支原体16S rRNA通用引物扩增基因序列并测序,使用DNAStar软件将分离菌株测序结果与GenBank中的标准株序列进行同源性比对,采用Mega 6.0软件中的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)依据16S rRNA序列构建分离株系统进化树。结果显示,分离株菌落呈典型的"煎蛋样",菌落中心凹陷深入培养基,周边菲薄而透明,经Dienes染液染色后,菌落中心呈深蓝色。该分离株不分解葡萄糖、尿素、不水解精氨酸,血细胞吸附试验和溶血试验均呈阴性,氯化三苯基四氮唑还原反应呈阳性,产生膜和斑。PCR反应扩增出大小为1 911 bp的牛支原体特异性目的片段;分离株16S rRNA基因序列与牛支原体标准株PG45的序列同源性为99.8%,与牛支原体地方株(Mb NM2012、Mb HB0801、Mb Hubei-1、Mb Ningxia-1、Mb CQ-W70和Mb 08M)的同源性为99.3%～99.7%。系统进化树显示,分离株16S rRNA基因与Mb Ningxia-1株和Mb 08M株亲缘关系较近,处于同一分支。本研究结果证实了引起病牛死亡的病原为牛支原体,为新疆牛支原体病的防治提供了科学依据。     

草原革蜱和边缘革蜱的分子生物学鉴定

本研究旨在建立草原革蜱和边缘革蜱的分子生物学鉴定方法,并探讨其系统发生关系。在新疆从动物体表采集寄生蜱,形态学鉴定后,PCR扩增获得2种革蜱的16S rRNA及线粒体色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因序列,测序后进行同源性分析。用Mega 5.0和Mrbayes 3.2软件分别构建系统进化树,草原革蜱16S rRNA序列与GenBank数据库中已知草原革蜱16S rRNA序列聚类,而边缘革蜱COⅠ序列与GenBank数据库中已知边缘革蜱COⅠ序列聚类,与形态学鉴定结果一致。本研究结果表明,在传统形态学分类的基础上,结合分子生物学鉴定方法能简易、准确鉴定草原革蜱和边缘革蜱。     

羊源性D型产气荚膜梭菌的分离及PCR鉴定

对青海省互助县送检的2份病死羊组织,经细菌学厌氧分离培养,参考已发表的产气荚膜梭菌16S rRNA基因和毒素基因(α、β、ε、ι)合成引物,采用PCR和多重PCR扩增目的基因条带,并对分离株细菌的16S rRNA基因序列进行了同源性及系统发育分析。结果显示:从其中1份病死羊组织中分离获得1株β溶血型革兰阳性杆菌,经PCR和多重PCR扩增可得16S rRNA基因和α、ε毒素基因的目的条带;分离株细菌的16S rRNA基因序列与GenBank上已登录(登录号:NR113204.1、NR121697.2)的产气荚膜梭菌的相应序列具有高度同源性(≥99.0%),同KU714939.1的遗传关系最为亲密,因此经分子生物学方法鉴定分离株细菌为D型产气荚膜梭菌。     

梨形虫和伊氏锥虫双重PCR检测方法的建立

为了建立梨形虫(Piroplasmida)和伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)的双重PCR检测方法，试验根据梨形虫的18S rRNA基因和伊氏锥虫的kDNA基因设计两对特异性引物，以吕氏泰勒虫和伊氏锥虫阳性样品DNA为模板进行单重PCR和双重PCR,并对双重PCR的退火温度进行优化，对本研究建立并优化的双重PCR方法进行特异性试验、敏感性试验及临床样品的检测。结果表明：本研究建立的双重PCR方法能够扩增出350 bp和600 bp的特异性目的条带，而无浆体、肝簇虫、弓形虫和埃立克体样品均呈阴性，梨形虫和伊氏锥虫最低检测浓度分别为54.70 fg/μL和14.30 fg/μL,用本试验建立的方法对临床样品的检测结果与对照方法(巢式PCR)检测结果一致。说明本研究成功建立了灵敏、快速、简便、特异性高的双重PCR检测方法，能够用于梨形虫和伊氏锥虫的临床检测及流行病学调查。