鹦鹉喙羽症病毒Cap蛋白的原核表达与纯化

鹦鹉喙羽症病毒(PBFDV)是圆环病毒科圆环病毒属的成员,可引起多个品种鹦鹉的急性死亡或者羽毛脱落和喙变形。病毒基因组中的ORF1和ORF2分别编码病毒复制相关蛋白(Rep protein)和衣壳蛋白(Cap protein)。Cap蛋白是圆环病毒的主要结构蛋白,也是其主要的免疫保护性蛋白。本试验应用PCR技术选择性扩增PBFDV Cap蛋白抗原表位集中区域的基因片段,并将其克隆入原核表达载体pGEX-6p-1中,诱导表达截短的Cap蛋白。SDS-PAGE及质谱鉴定结果显示,融合表达的CapT蛋白约45 kDa,切胶纯化后的蛋白浓度约1. 6 mg/mL。该Cap蛋白的成功获得为PBFDV治疗用阳性血清制备及亚单位疫苗的开发奠定了必要的物质基础。     

牛赤羽病胶体金抗体检测试纸条的研制

研究旨在制备一种现场快速筛查牛赤羽病的免疫层析试纸条。通过胶体金标记赤羽病病毒N蛋白,将兔抗牛IgG和兔抗N蛋白多克隆抗体分别喷涂于NC膜上作为检测线（T）和质控线（C）。结果显示,牛赤羽病毒阳性抗体血清稀释度为1∶512时,检测线仍显色;且与牛病毒性腹泻病毒、牛结核病、布鲁氏菌病、牛巴氏杆菌病、地方流行性牛白血病毒和蓝舌病毒的阳性血清均无交叉反应;使用试纸条和商品化ELISA试剂盒同时检测40份田间牛血清样品的结果符合率为92.6%。研究表明,试纸条适用于基层养殖户对牛赤羽病的筛查。     

赤羽病病毒Gcaa465～704的杆状病毒表达和单克隆抗体制备

为制备针对赤羽病病毒(AKAV)糖蛋白Gc的单克隆抗体(mAb),本试验选取AKAV Gc蛋白第465～704位氨基酸的基因序列进行密码子优化并合成至pFastBac HTB载体;通过蓝白斑筛选和昆虫细胞杆状病毒表达系统制备重组AKAV Gc_aa465～704蛋白,纯化后免疫小鼠;通过细胞融合和亚克隆筛选阳性杂交瘤细胞,利用Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)对mAb特性进行鉴定。结果显示,本试验成功筛选出1株可稳定分泌抗AKAV Gc_aa465～704蛋白mAb的杂交瘤细胞株4D1,Western blot结果显示,mAb 4D1可特异性识别AKAV Gc_aa465～704蛋白;IFA结果显示,mAb 4D1能够与AKAV感染的BHK21细胞发生反应。结果表明,本试验成功制备抗AKAV Gc_aa465～704蛋白mAb,为进一步研究AKAV Gc蛋白生物学功能和建立AKAV检测方法提供技术支持。     

鲤鱼双线绦虫裂头蚴的分子鉴定和系统发育关系分析

为了鉴定天津市某养殖场鲤鱼腹腔内寄生的“面条样”虫体，本试验通过PCR方法扩增虫体的18S rRNA、COⅠ和COB基因序列，并进行分子鉴定和基因测序，分析3种基因的同源性、分子进化和系统发育关系。结果显示，寄生于鲤鱼体内的虫体的18S rRNA、COⅠ和COB基因序列分别与双线绦虫分离株MN204040.1(中国)、MN219466.1(中国)和EU241209.1(法国)的核苷酸序列同源性较高，为99.45%、98.74%和99.26%。基于18S rRNA、COⅠ和COB基因序列构建的系统发育树显示，本试验分离的绦虫裂头蚴与GenBank数据库中已鉴定的双线绦虫聚在同一分支上，且与双线绦虫中国武汉分离株的种属亲缘关系较近。本试验初步阐明获得的天津市双线绦虫分离株与其他种属之间的系统发育关系，为双线绦虫的分子鉴定和系统发育关系分析提供了数据支持。     

非洲猪瘟病毒MGF-505R基因缺失株双重荧光RPA检测方法的建立及应用

旨在建立一种快速现场筛查非洲猪瘟病毒(ASFV)基因缺失株的方法，以便鉴别我国复杂的ASFV感染情况。通过分析国内ASFV流行态势，选择MGF-505R基因及B646L基因，设计特异性引物及exo探针，对其进行敏感性、特异性分析，并进行临床应用。利用双重-重组酶聚合酶扩增(RPA)方法检测ASFV MGF-505R及B646L基因，结果显示：检测时间在15 min内，最低检测限均为10 copies/反应，且与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型等均无交叉反应；利用所建立方法对266份临床样品进行检测，结果与世界动物卫生组织(WOAH)推荐荧光PCR检测方法的符合率为100%。建立的ASFV MGF-505R基因缺失株的荧光RPA检测方法适配可移动式荧光RPA检测仪，具有快速、灵敏度高、特异性强的优点，适用于ASFV现场快速临床检测，为非洲猪瘟疫情防控提供一种新的筛查手段。     

非洲猪瘟病毒CD2v蛋白阻断ELISA候选单克隆抗体的筛选及免疫学特性鉴定

为制备非洲猪瘟病毒CD2v蛋白阻断ELISA候选单克隆抗体,并探究其免疫学特性,以真核表达的CD2v蛋白免疫BALB/c小鼠,经两次免疫后采集小鼠血清,以间接ELISA检测小鼠多抗血清效价。对血清效价最高的小鼠进行加强免疫后,取脾脏进行细胞融合。通过有限稀释法筛选能够稳定分泌CD2v单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用小鼠体内诱生腹水法和辛酸-硫酸铵法获得纯化的CD2v单克隆抗体,对其进行免疫学特性检测。间接ELISA试验显示,4号小鼠血清效价最高(1:72 900),选取该小鼠脾脏进行细胞融合,经过筛选得到4株杂交瘤细胞,分别命名为21D10、21G8、36A3和38G8,亚型鉴定均为IgG₁/κ,经检测36A3 ELISA效价最高,可达1:2.187×10⁵。免疫荧光试验显示,36A3抗体能与细胞内表达的CD2v蛋白发生特异性反应,而与携带His标签的p30蛋白无交叉反应;特异性鉴定结果显示,36A3抗体特异性良好,与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及非洲猪瘟病毒p72蛋白均无反应;亲和力检测显示,36A3抗体亲和力较高,亲和...     

鱼类细胞系研究现状

鱼类细胞系是研究鱼类病毒学、生理学、毒理学、免疫学和分子遗传学的重要材料和重要的体外研究系统。鱼类细胞系的组织来源包括脑、心脏、鳃、肾脏、鳍条和卵巢等各种组织。目前已至少建立并应用了826株鱼类细胞系。本文综述了近年来鱼类细胞系的组织来源、培养方法及应用现状，旨在为鱼类细胞系研究提供最新的数据支撑。