PEDV 流行毒株抗体对不同亚型毒株的中和试验

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是一种通过小肠感染,引起猪呕吐、腹泻、脱水的急性高度接触性传染病。2010年起在我国迅速暴发,对仔猪的致死率高达80%～100%。PEDV可分为G1 (G1a、G1b)与G2 (G2a、G2b)基因亚型,各亚型病毒纤突(S)蛋白基因序列存在缺失、插入和大量点突变。为进一步研究S蛋白序列的差异是否造成病毒抗原性的差异,本试验采集猪流行性腹泻流行毒感染猪只肛拭子进行PEDV-S蛋白基因序列比对分析,并对感染康复猪只采集血清进行中和试验,研究PEDV流行毒株血清抗体与不同基因亚型毒株中和反应情况。结果显示,流行毒(G2a)感染猪只血清抗体中和PEDV不同亚型病毒株,中和能力存在显着差异。对PEDV-A (G2a)毒株的中和能力最强,均值为1:60,对PEDV-B(G2b)株中和能力次之,均值为1:20,对CV777 (G1a)毒株无中和能力。     

口蹄疫双佐剂灭活疫苗免疫动物抗体持续期的研究

一、材料与方法1.疫苗佐剂:法国SEPPIC公司生产的206佐剂成品,双佐剂自行配制。2.口蹄疫病毒抗原:O型和Asia-1型病毒,按生产规程灭活后制备成疫苗用抗原。3.主要检测试剂盒:液相阻断     

新疆某牛场大肠杆菌的分离鉴定及16S rRNA序列分析

为了调查新疆某规模化奶牛场犊牛腹泻的原因并确定病原,无菌采集15份腹泻犊牛粪样进行病原的分离培养,采用形态学观察、生化试验、血清学和致病性分析等方法鉴定分离菌株,利用大肠杆菌16S rRNA通用引物进行基因序列扩增并测序,使用DNAStar软件将分离菌株测序结果与GenBank中的其他菌株序列进行同源性比对,采用Mega 6.0软件依据16S rRNA序列构建分离株系统进化树并进行分析,同时对分离菌株的黏附性基因进行鉴定。结果从15份样品中分离获得2株分离菌株;试验显示,分离株均发酵葡萄糖,MR试验、吲哚和甲基红试验呈阳性,硫化氢、氧化酶、DNA酶、VP试验呈阴性。2株分离菌株血清型均为O78,且均具有致病性。药敏试验显示,分离菌株均对环丙沙星、卡那霉素、氟哌酸、庆大霉素、磺胺甲唑、头孢哌酮、壮观霉素、多黏菌素B、呋喃妥因敏感。分离株16S rRNA基因序列与大肠杆菌菌株NF738(GenBank登录号:MT649856)同源性为≥99.7%,且处于同一大分支。经PCR鉴定,分离菌株具有K88黏附性基因。本研究结果证实了引起新疆某规模化奶牛场犊牛腹泻的病原为致病性产肠毒素型大肠杆菌。     

基因修饰的鸡新城疫病毒HN基因DNA疫苗免疫效力评价

为了评价基因修饰对提高DNA疫苗免疫效果的影响,将NDV F48E9株HN基因进行密码子优化和信号肽替换,修饰后的基因命名为SoptiHN,将HN和SoptiHN基因分别克隆至pVAX 1和含CpG-ODN刺激序列的载体pVAX 1-CpG中,共获得pV-SoptiHN、pVC-SoptiHN、pV-HN和pVC-HN 4种质粒.将4种质粒股四头肌多点注射3周龄SPF鸡,每只鸡200 μg,以PBS为非免疫对照;一免后3周以相同的剂量加强免疫,二免后2周以103EID50NDV的F48E9强毒株进行攻毒,计算发病率、死亡率以及排毒情况.试验期间每周采集血清进行HI抗体的检测,同时采集抗凝血分离外周血淋巴细胞,分析免疫后各试验组IFN-y和IL-18的变化情况.结果表明,疫苗免疫1周后,所有免疫组均能产生抗NDV的HI抗体,pV-SoptiHN和pVC-SoptiHN组最高,与其他组差异显著;pVC-SoptiHN和pVC-HN质粒免疫组IFN-γ和IL-18表达水平要略高于pV-SoptiHN和pV-HN质粒免疫组.攻毒结果显示,pV-SoptiHN与pVC-SoptiHN免疫组的死亡保护率均为71%,排毒检出率均为25%,而pV-HN和pVc-HN免疫组的保护率均为50%,排毒检出率分别为50%和44%,pVAX1、pVAX1-CpG和PBS对照组攻毒后的死亡率均为100%,排毒检出率均为100%,pV-SoptiHN与pVC-SoptiHN免疫组的排毒时间与其他5组相比有所缩短.以上结果表明,修饰后的HN基因可以诱导鸡产生更强烈的免疫反应,获得更好的保护效率.     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清5型的分离鉴定

新疆奇台和昌吉市规模化猪场发生育肥猪急性死亡,疑似猪传染性胸膜肺炎,采集病料进行细菌的分离培养、PCR检测、药敏试验及小鼠致病性试验。结果分离获得猪胸膜肺炎放线杆菌奇台株2株,昌吉株1株。PCR分型鉴定均为血清5型。致病性试验显示,分离株均可致死小鼠。对氟苯尼考、头孢噻呋、恩诺沙星等抗生素敏感。结论,确诊病原为猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型。血清5型已成为新疆地区致死率较高的流行血清型。     

三价口蹄疫灭活疫苗免疫猪后免疫效果监测

为了应对现在可能出现的A型口蹄疫疫情,本试验对口蹄疫A型、O型和亚洲1型三价灭活疫苗在猪上的使用情况进行了验证,选取了45日龄左右的仔猪36头,妊娠母猪5头,进行了疫苗免疫,并定期监测其O型、A型抗体水平,免疫后30 d仔猪O型、A型抗体水平合格率均能达到80%以上,二次免疫后可达100%,妊娠母猪免疫后O型、A型抗体水平合格率均能达到100%,所产仔猪14 d的O型抗体水平合格率也可以达到85%。     

猪瘟病毒E2蛋白双抗体夹心ELISA定量方法的建立

本研究旨在建立定量检测猪瘟病毒（CSFV）E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA方法。用 CSFV WH303单克隆抗体包被96孔酶标板,用CSFV 1B6单克隆抗体连接HRP作为酶标抗体,以杆状病毒表达纯化的CSFV E2蛋白作为标准品蛋白,建立双抗体夹心ELISA定量方法。用SDS-PAGE方法检测标准品蛋白的纯度,BCA蛋白定量法定量标准品蛋白的浓度。稀释标准品至线性区间,绘制标准曲线。用棋盘法确定包被单克隆抗体和酶标抗体及标准品蛋白的最适稀释度。用批间重复和批内重复试验验证该方法的重复性和稳定性。SDS-PAGE结果显示,CSFV E2蛋白的标准品纯度>95%,BCA蛋白定量法测定CSFV E2蛋白的标准品浓度为1.553 mg/mL。包被单克隆抗体的浓度为0.1 μg/mL,酶标抗体的最适稀释度为1∶400。CSFV E2蛋白标准品稀释浓度在2.43~77.65 μg/mL范围内有很好的线性关系,相关系数R²值在0.99以上。批间和批内重复性检测试验变异系数均<15%。本试验成功建立了定量检测CSFV E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法,该方法具有良好的重复性和稳定性,为CSFV E2蛋白的定量提供了有效方法。     

牛支原体新疆分离株oppD/F基因克隆及分子特征分析

试验旨在分析牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列,并探究其序列特征及编码蛋白的结构和功能。根据GenBank中PG45菌株oppD/F基因序列（登录号：AF130119.1）设计1对引物,应用PCR技术扩增获得分离株oppD/F基因,将oppD/F基因片段克隆至pMD19-T载体中进行测序,在采用生物信息学方法分析其核苷酸序列的基础上对其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、可溶性、信号肽、跨膜域、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构和功能等进行分析和预测。结果显示,牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列全长1 617 bp,与Mb PG45株和Mb JF4278株的同源性均为100%,处于同一分支;该基因编码蛋白是由539个氨基酸残基组成,不存在信号肽及跨膜结构,是一种稳定的亲水性蛋白质;oppD/F蛋白存在1个AAA家族结构域,50个潜在的磷酸化位点和3个糖基化位点,其二级结构是混合型,其中α-螺旋所占比例最高（61.78%）,无规则卷曲次之（20.78%）。功能预测结果显示,oppD/F蛋白在信号传导、受体、结构蛋白、离子通道、免疫应答和胁迫应答等方面的几率均较高。本研究结果为进一步分析牛支原体oppD/F基因的功能提供了一定的理论依据。     

猪多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素亚单位蛋白的制备及免疫原性研究

为获得针对猪萎缩性鼻炎主要病原体——多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素的高免疫原性抗原，本试验构建、表达并验证该毒素的亚单位蛋白抗原，将猪多杀性巴氏杆菌毒素PMT基因与pMD19-T载体进行连接、转化，经序列分析鉴定后，分别使用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ与Blp Ⅰ限制性内切酶将其酶切为3个基因片段。将片段1（Tox1）、片段2（Tox2）和片段3（Tox3）分别亚克隆至原核表达载体pET32-b、pET32-a和pET32-b中，构建3个重组表达载体。将重组表达载体转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导后，分别进行SDS-PAGE与Western blotting检测，并使用小鼠与豚鼠初步研究其免疫原性。结果显示，构建的3个基因片段长度分别为776、409与410 bp，与GenBank中相关序列具有高度同源性；3个蛋白片段表达正常，表达量分别达到379.95、447.62与459.82 μg/mL，SDS-PAGE验证条带分别为75、77与53 ku；因3个片段位置不同，仅Tox3有Western blotting检测条带，与理论预测相符；使用3种表达蛋白免疫小鼠与豚鼠后，二免后14 d，血清经试剂盒检测阳性率达到100%，对二免后14 d小鼠攻毒保护率达到93%。本研究成功构建了PMT的3个亚单位活性片段，且具有较好的免疫原性。     

三种检测多杀性巴氏杆菌毒素灭活方法的研究

正产毒多杀性巴氏杆菌(toxigenic Pasteurella multocida,T+Pm)是猪传染性萎缩性鼻炎(atrophicrhinitis,AR)的主要病原菌,能引起猪只鼻甲骨萎缩,破坏鼻黏膜免疫屏障,进而继发其他呼吸道疾病,造成养猪业的重大经济损失[1]。研究发现,T+Pm可引起进行性萎缩性鼻炎,其中以多杀性巴氏杆菌毒素(Pasteurella multocida toxin,PMT)为主要的致病因子。大量研究结果表明,PMT是T+Pm的主要毒力因