基于18S rRNA基因测序基础上的锥虫分子分类学

利用18S rRNA基因序列分析方法,对我国湖北、广西、新疆和浙江4省的伊氏锥虫及1株布氏锥虫进行分子分类学研究.用分离的锥虫感染实验动物,自感染小鼠的红细胞或全血中提取基因组DNA,根据GenBank中已发表的雏虫18S rRNA序列设计1对锥虫通用引物,通过PCR扩增目的基因片段,将扩增产物连接到pGEM-T载体中,经酶切、PCR确定,进行序列测定.结果显示,7个锥虫分离株的18S rRNA基因大小为2 188 bp.利用DNAS-tar对试验所获得的这7株锥虫和GenBank中部分锥虫的18S rRNA基因进行比较分析,建立2个进化系统发生树.核苷酸同源性比较及系统发生树显示:自我国上述4省分离的伊氏锥虫来源于同一株系,布氏锥虫和广西分离的伊氏锥虫株的18S rRNA核苷酸与其他锥虫分离株仅有较小差异,与国外的6株锥虫的同源性为99%～100%,与另外7株的同源性为62%.     

黄鳝胃瘤线虫ITS及5.8S rDNA的克隆及序列分析

本研究旨在阐明黄鳝胃瘤线虫湖南分离株的核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)及5.8 S rDNA序列的遗传变异情况,并用ITS序列重构胃瘤线虫与其它线虫的种群遗传关系.利用聚合酶链反应(PCR)扩增胃瘤线虫rDNA的ITS-1、5.8S及ITS-2片段,将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体,重组质粒通过菌落PCR鉴定后,对阳性菌落进行序列测定并进行序列分析.结果显示所获得的胃瘤线虫ITS及5.8 S rDNA序列总长存在一定差异(922～927 bp),其中包含部分的18S、28 S及全部的ITS-1 (350～351 bp)、5.8S(102 bp)及ITS-2 (340～344 bp)序列.本研究系国内首次报道胃瘤线虫的ITS序列,其结果为黄鳝胃瘤线虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查和群体遗传研究奠定了基础.     

伊氏锥虫HGPRT基因的RT-PCR扩增及克隆

参照布氏锥虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT)基因的核苷酸序列 ,设计合成了 1对引物 ,引物间距为 63 0 bp,包含完整的 HGPRT基因。以伊氏锥虫湖北水牛株总 RNA为模板进行 RT-PCR扩增 ,琼脂糖凝胶电泳显示 ,获得 1条长约 63 0 bp的特异性条带 ,符合设计要求。扩增片段克隆于 p GEM-T Easy载体 ,经筛选鉴定 ,证明已获得了 HGPRT基因阳性克隆。核苷酸序列分析表明 ,克隆的 HGPRT基因在重组质粒中的连接向位和阅读框架是正确的。二级结构和疏水性分析表明 ,HGPRT基因产物具有复杂的空间结构 ,提示有良好的抗原性     

湖南省猬迭宫绦虫ITS及5.8S rDNA的克隆及序列分析

利用聚合酶链反应(PCR)扩增猬迭宫绦虫rDNA的ITS-1、5.8S及ITS-2片段,将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体,重组质粒通过菌落PCR鉴定后,对阳性菌落进行序列测定并进行序列分析。结果显示,所获得的ITS及5.8S rDNA序列总长存在一定差异,为1 369~1 393 bp,包含部分的18、28S及全部的ITS-1(662~687 bp)5、.8S(138 bp)及ITS-2(457~475 bp)序列。由于猬迭宫绦虫ITS序列种内相对保守,种间差异较大,故可作为种间遗传变异研究的标记。     

伊氏锥虫、马媾疫锥虫、布氏锥虫、刚果锥虫的18S rDNA部分序列测定与系统发育关系

对伊氏锥虫（Trypanosoma evansi）：新疆株（XJCA）、湖北株（HBM）、云南株（YNB）、广东株（GDB2）；马媾疫锥虫（Trypanosoma equiperdum）、布氏锥虫（Trypanosoma brucei）、刚果锥虫（Trypanosoma congolense）提取基因组DNA，根据已报道的伊氏锥虫株18SrDNA基因序列设计合成引物，用PCR扩增了锥虫虫株基因组DNA,伊氏锥虫新疆株、湖北株、云南株、广东株、布氏锥虫、刚果锥虫均为373bp的片段；马媾疫锥虫为372bp的片段，PCR产物经电泳鉴定后用试剂盒回收纯化，纯化后PCR产物经连接、转化后测序，将测得的序列用DNAMAN软件分析并与国外已发表的相应序列进行了同源性比较，并绘制了系统发育进化树。结果与国外AJ009153、AJ223564、D89527株同源性达到99％～100％，与另外11株同源性75％。本研究为锥虫分子流行病学研究及分类研究打下基础。     

鸡蛔虫凉山州分离株ITS和5.8SrDNA序列测定及种系发育分析

应用保守引物BD1和BD2对7个鸡蛔虫凉山州分离株的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)及5.8S rDNA序列进行PCR扩增和序列测定,并用ITS-1、ITS-2序列重构鸡蛔虫与其他蛔虫的系统发育关系。测序结果显示所获得的鸡蛔虫ITS及5.8S rDNA序列大小为974~989 bp,同源性为98.9%~100.0%。其中ITS-1、5.8S rDNA和ITS-2片段大小分别为473~481、157和337~359 bp,同源性分别为98.5%~100.0%、100.0% 和98.5%~100.0%。系统发育树显示所有鸡蛔虫分离株聚在同一分支,能与其他蛔虫相区别。研究结果表明,鸡蛔虫的ITS-1、ITS-2序列种内变异小,但种间差异大,故可作为分子标记用于鸡蛔虫的虫种鉴定,为鸡蛔虫的分子分类、分子流行病学调查和种群遗传的进一步研究奠定基础。     

长颈鹿血矛线虫ITS的PCR扩增与序列分析

目的利用分子生物学方法对来自长颈鹿皱胃的血矛线虫进行虫种鉴定。方法对样品XM9和XM11的核糖体DNA内转录间隔区(ITS-1、5.8 S、ITS-2)进行PCR扩增及序列分析,并与GenBank公布的血矛线虫(Hae-monchus)相应序列进行比较。结果来自长颈鹿皱胃的2条血矛线虫具有相同的ITS序列,5.8 S与ITS-1分别为153 bp、404 bp,与GenBank分布的捻转血矛线虫序列是一致的。ITS-2序列为231 bp,第753位是一个多态位点,该序列与来自国外的H.contortus,H.placei,H.longistipes存在0-18个碱基差异。结论来自长颈鹿的血矛线虫是捻转血矛线虫。     

蛇蛔虫ITS及5.8S rDNA的克隆及进化分析

利用聚合酶链反应（PCR）扩增蛇蛔虫rDNA的ITS-1、5.8S及ITS-2片段,将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体,重组质粒通过菌落PCR鉴定后,对阳性菌落进行序列测定并进行序列分析。结果显示,所获得的蛇蛔虫ITS及5.8SrDNA序列总长为846bp,包含部分的18S、28S及全部的ITS-1、5.8S及ITS-2序列。本研究系国际上首次报道蛇蛔虫的ITS序列,从而为蛇蛔虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查奠定了基础。     

白鹈鹕体内对盲囊线虫种类的鉴定及其ITS序列分析

为了鉴定从广东某地圈养的白鹈鹕体内的线虫种类,2个样本通过形态学观察初步鉴定为对盲囊线虫后,对虫体核糖体DNA（rDNA）内转录间隔区ITS-1、ITS-2及5.8SrDNA序列进行扩增和测序,并与GenBankTM公布的序列进行比对,构建系统发育树分析,确定其种类.结果显示,白鹈鹕体内线虫符合对盲囊线虫的形态学特征,其ITS-1序列长度为463 bp,与Contracaecum sp.（GenBankTM登录号：KF990496.1）ITS-1的序列相似性分别为98.9％、99.8％;ITS-2序列长度分别为288-289 bp,与C.bancrofii（GenBankTM登录号：FM177887.1）的ITS-2序列的相似性分别为96％、95％;5.8SrDNA序列长度为157 bp.通过以ITS-1序列为分子标记的系统发育树分析,白鹈鹕体内线虫与C.bancrofti属同一分支,应为C.bancrofii.形态学鉴定方法结合ITS序列分析可以准确鉴定白鹈鹕体内线虫的种类,为其他线虫的快速准确鉴定提供参考.     

我国犬钩虫ITS及5．8SrDNA的克隆与序列分析

以从我国广东湛江犬小肠中采集的2条犬钩虫作为研究对象，用保守引物NC5及NC2扩增犬钩虫rDNA的ITS-1、5．8S及ITS-2片段，将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-TEasy载体，重组质粒通过菌落PCR和酶切鉴定后，对阳性菌落进行序列测定并进行序列分析。结果显示，来自湛江的2条犬钩虫ITS及5．8SrDNA序列总长均为738bp，其中ITS-1序列长为364bp，5．8S序列长为153bp，ITS-2序列长为221bp；2个不同样品之间ITS序列存在多态性，ITS-1序列存在5个碱基的差异，ITS-2序列存在1个碱基的差异，5．8SrDNA序列无差异。研究结果为犬钩虫进一步的分类、鉴定和遗传变异研究奠定了基础。     

3种冠环线虫rDNA-ITS的PCR扩增及序列分析

本试验利用PCR扩增3种冠环线虫5个样品的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)及5.8S片段,将PCR扩增产物纯化后直接进行序列测定和分析。序列比对和分析结果显示,所测样品ITS1-5.8S-ITS2的长度范围为748~843 bp,总变异位点(包括gaps)119个,简约信息位点18个;其中ITS1和ITS2的长度范围分别为367~370 bp和228~320 bp,变异位点分别为14个和105个,简约信息位点均为9个。所有测试样品的5.8S片段完全相同,长度为153 bp。5条序列ITS1区的G+C含量(48.0%~48.5%)明显高于ITS2区(37.7%~40.3%)。通过序列两两比对,3种冠环线虫ITS1和ITS2的种间差异性分别为1.9%~3.5%和5.6%~31.8%;而种内差异性分别为0~0.5%和0~0.9%。并且所测序列与GenBank中已知序列的同源性为99.07%~99.41%。本研究认为,ITS序列可以作为冠环线虫种类鉴定的分子标记。     

Specific polymerase chain reaction for differential diagnosis of Dirofilaria immitis and Dipetalonema reconditum using primers derived from internal transcribed spacer region 2 (ITS2)

Both Dirofilaria immiti and Dipetalonema reconditum may be found in blood of infected dogs but it is not easy to distinguish D. immitis from D. reconditum in morphology. We cloned and sequenced the contiguous internal transcribed spacer (ITS) region, ITS1-5.8S-ITS2, of these two different parasites and published on GenBank as AF217800 for D. immiti and AF217801 for D. reconditum in this study. We designed two pairs of specific primers derived from ITS2 being used for polymerase chain reaction (PCR). The amplicons of ITS2 from D. immiti and D. reconditum are 302 and 348bp, respectively. Moreover, the limitation for amplifying ITS2 gene using this PCR demonstrated that 1 x 10(-2) microfilaria of each species of parasite smashed or even with mixed samples could be detected and the PCR products were predicted as the same as that described above. Thus, D. immiti and D. reconditum could be differentially diagnosed by this specific PCR. Seventeen clinical cases were evaluated and all of them were correctly identified. In this study, ITS1-5.8S-ITS2 of D. immiti or D. reconditum were the first time sequenced and analyzed. No significant similarity of ITS1 and ITS2 between D. immiti and D. reconditum could be observed.     

不同地理株伊氏锥虫灭活苗交叉免疫保护及免疫方法研究

用伊氏锥虫湖北株和广西株制备纯虫灭活苗和含血灭活苗,经小鼠１次、２次免疫,再经强毒伊氏锥虫湖北株、广西株和江苏株交叉攻击。结果湖北株纯虫灭活苗２次免疫鼠,对同株（湖北株）获得３０／３０保护,对异株即广西株和江苏株分别获０／１０和７／１０保护,该苗一次免疫鼠对同株仅获得５／１０保护。广西株纯虫灭活苗２次免疫鼠对同株（广西株）获２０／２０保护,对异株即湖北株和江苏株分别获得０／１０和４／１０保护。含血湖北株伊氏锥虫灭活苗对同株无保护作用,１３只免疫小鼠全部死亡,对江苏株（异株）为９／１０死亡。对照小鼠全部发病死亡。交叉免疫保护试验结果说明,纯虫灭活苗经两次免疫后对伺株虫体产生坚强的免疫保护作用,免疫保护率达１００％,不同地理株伊氏锥虫因抗原变异现象出现不同的免疫保护作用。两次免疫接种小鼠其免疫保护效果比一次免疫的效果好。疫苗中如含有大量非特异物质,虫苗的免疫保护作用将完全丧失。稳定试验表明,灭活苗在室温下保存１个月,在４℃、－２０℃下保存６个月,免疫效果不变。     

河北兔场皮肤病原真菌rDNA-ITS序列分析

利用皮肤真菌核糖体内转录间隔区（ITS）序列通用引物,对采自河北省兔场的5种皮肤真菌病进行了PCR扩增,ITS区的克隆、测序、序列变异及遗传进化关系分析。经与GenBank核酸序列数据库数据比对和形态学观察结果表明：有4种真菌被鉴定,分别为须毛癣菌、多聚曲霉、球孢白僵菌和产黄青霉,1种未鉴定;不同病原菌的5.8SrDNA序列高度保守,而ITS区的变异性则较高。该研究确定ITS区序列分析可用于兔皮肤病原真菌的分离。     

弓形虫ITS及5.8S序列的PCR扩增、克隆及分析

通过对国内来源于不同宿主的ZS人株、SH人株、CN猪株、QH绵羊株4个弓形虫虫株，以及国际标准强毒株RH株的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)及5．8SDNA序列进行PCR扩增、克隆、测序和序列分析，旨在对国内不同宿主间弓形虫虫株的遗传变异情况进行分析和验证。为分子遗传学和分子诊断学研究提供资料。结果显示：QH绵羊株、ZS人株、SH人株、CN猪株的ITS及5．8S序列完全一致。且与GenBank上注册RH株的ITS及5．8S序列也一致；仅实验室传代保存的RH株的ITS2序列与其它4株的ITS2有2个碱基的差异。结果表明ITS可作为分子标记用于弓形虫与其它原虫的种间鉴定。但不适合用于弓形虫种内遗传变异的研究。     

骆驼刺青贮中胶红酵母菌分离鉴定和菌株特性研究

用青贮骆驼刺进行倍比稀释、涂布获得单菌落,单菌落在PDA培养基上划线纯化,获得3株革兰氏阳性菌,经菌落形态特征鉴定、生理生化特征鉴定及ITS（ITS1＋5.8S＋ITS2）序列同源性分析,结果表明：其中1株菌红色单菌落的细胞形态呈圆形或椭圆形且中央隆起,能够利用蔗糖、D-半乳糖等多种碳源和（NH4）2SO4、L-谷氨酸2种氮源,不利用KNO3,5.8S rDNA测序的序列全长616 bp,采用DNA Star软件分析序列与胶红酵母标准菌株ATCC 4054（NCBI登录号：KC881069）的5.8S rDNA基因序列同源性为99.8%,确定其为胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）。     

桑属植物ITS序列研究与系统发育分析

用PCR产物直接测序法对桑属的 9个种 3个变种共 13份桑种质和构属构树的ITS序列进行了测定。结果表明 :桑属植物ITS1长度平均约为 189bp;桑属 5 8SrRNA为 15 2bp ;ITS2长度平均为 2 12bp ;桑属植物ITS序列G +C含量为 6 0 %左右。用DNASTAR软件构建了桑属植物ITS序列的系统发育树 ,并探讨了参试桑种质的亲缘关系。     

鹅细小病毒安徽分离株NS和VP基因的克隆及序列分析

为研究安徽省鹅细小病毒（goose parvovirus,GPV）的遗传变异特征,本研究通过PCR扩增获得GPV基因AH,并与天鹅、番鸭、雁鹅等宿主的GPV相应基因序列进行了比对。序列分析可见,AH基因包括完整的NS和VP基因,长度分别为1 884和2 199 bp,分别编码2个非结构蛋白和3个结构蛋白。遗传进化分析显示,安徽分离株AH基因与重庆分离株毒株RC16及安徽分离的强毒株Y、E、Yan-2等基因序列的遗传距离较近;而与安徽分离的鸭源细小病毒株DS15和匈牙利分离株Virulent B,尤其是与疫苗株SYG61v遗传距离较远。同源性分析结果表明,AH-NS基因与毒株RC16核苷酸序列同源性最高,为99.6%;与疫苗株SYG61v同源性最低,为94.3%;AH-VP基因与毒株RC16的核苷酸序列一致,而与毒株DS15同源性仅为95.2%。安徽GPV AH基因序列与强毒株的基因位点一致,在VP3基因的第797、1 141、1 144、1 169和1 185 bp处分别为G、A、G、C、T,结合该毒株引发疾病的严重程度,符合高致病力毒株特点。本试验结果表明,GPV同源性普遍较高,宿主范围较广泛,对不同品种水禽均有较强的侵染力。